基于组学技术的植物体细胞胚胎发育研究进展

王 浩, 白玉娥

(内蒙古农业大学林学院, 内蒙古 呼和浩特 010018)

植物体细胞胚胎发生是单个细胞或组织没有受精过程，直接在体外诱导出胚性愈伤组织，分化成胚胎发育过程所形成的胚的类似物，并在适宜的条件下形成植株的过程[1].作为细胞全能性的一种体现方式，植物体细胞胚胎培养在遗传转化和工厂化快速繁殖等方面有着极其重要的意义.植物组织培养脱分化的愈伤组织分为两种，一种是没有能力分化出胚状体的非胚性愈伤组织，另一种是具有分化潜能和很强增殖能力的胚性愈伤组织[2]，在诱导胚性愈伤组织阶段的相关生理生化活性明显高于非胚性愈伤组织[3]，细胞内蛋白质和淀粉大量积累[4]，为胚性愈伤组织分化提供充足的营养物质和能量[5].

植物体细胞胚胎发育阶段可分为球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚，成熟后通过干化处理来促进体胚萌发.体胚发生途径与扦插、嫁接、分株和压条等常用植物无性繁殖方式比较，具有培养周期短、繁殖数量多和不受季节影响等优势，但由于胚性愈伤组织诱导率低、褐化现象严重、体胚发育进程难以统一、发育成正常苗木的体胚数量少、再生植株生长较弱等问题，导致植物体细胞胚胎体系建立较难，从而影响其广泛应用于规模化、自动化育苗[6].体细胞胚胎发生经历了类似合子胚发育的完整过程，因此，探究植物体细胞胚胎发生的分子调控机制不仅可以深入揭示体胚发育进程，也为研究合子胚发育的内在机理提供依据[7].

之前对植物体细胞胚胎的研究，主要集中于胚性愈伤组织的诱导、体胚发育形态特征及生理生化等方面的研究，对植物体细胞胚胎发生过程的分子机制缺乏足够的了解，随着组学技术的兴起，运用多组学数据，从基因水平、转录水平、蛋白水平以及代谢水平探究植物体细胞胚胎发生机制成为目前研究的热点.本文综述了各类组学技术植物体细胞胚胎发生研究中的应用现状，并讨论了植物体细胞胚胎发生过程中的主要问题和应用前景，有助于揭示植物体细胞胚胎发生的分子调控和复杂生化反应机制.

1 基因组学在植物体细胞胚胎研究中的应用

随着拟南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]等越来越多的植物全基因组测序完成，基因组学开始在植物研究中逐步得到应用.基因组学主要包括：结构基因组学(structural genomics)、表观基因组学(epigenomics)、功能基因组学(functional genomics)和宏基因组学(metagenomics).目前，表观基因组学结合体细胞胚胎发育的研究有所开展.表观基因组学是在基因组的水平上研究生物体表观遗传修饰的学科[10].表观遗传修饰是对细胞DNA或组蛋白的可逆修饰，在不更改DNA序列的条件下影响基因表达.表观修饰变异是植物在生长过程中，因为外部环境的变化作出一些适应性反应，这个过程可能会影响体细胞胚胎发生的能力.以基因组学为关键词在百度学术检索，发现有关基因组学在植物体细胞胚胎方面的研究论文在2010—2011年每年维持在1 500篇左右，2012—2015年每年约1 000篇，2016—2019年每年约500篇.

1.1 植物体细胞胚胎发生过程中的DNA甲基化调控

DNA甲基化是一种控制基因表达的表观调控机制，在植物生长发育方面发挥重要作用，与体胚发生紧密相关[11].Hao et al[12]研究表明，同一基因型纽荷尔脐橙(Citrusjunos)诱导体胚发生过程中，能产生体细胞胚状体的愈伤组织DNA甲基化水平低于不能产生胚状体的愈伤组织，这一结论在对甜菜(Betavulgaris)[13]的胚胎系与非胚胎系研究中也得到了验证.马尾松(Pinusmassoniana)[14]体细胞胚胎复生调控研究发现，胚性培养物中DNA总甲基化率最高的时期是复生调控期，而增殖初期和增殖旺盛期是半甲基化率最高时期.魏华丽等[15-16]研究表明，杂种落叶松(Larixleptolepis×L.principis-rupprechtii)和欧石楠(Erica)愈伤组织时期DNA甲基化水平均低于其他发育时期.李辉亮等[17]在对巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)体细胞胚发生发育的研究中发现，DNA甲基化程度最高和最低的时期分别是花药时期与体细胞胚时期.此外，李建英在棉花(Gossypiumspp.)愈伤组织到完整植株整个发育过程中，构建其全基因组单碱基分辨率甲基化图谱，发现非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织中DNA甲基化水平上升，胚性愈伤组织到体细胞胚中DNA甲基化水平下降，并且在非胚性愈伤组织中添加DNA甲基化抑制剂增加了胚胎的数量[18].

综上所述，植物体细胞胚胎发育的不同阶段，DNA甲基化程度不同，发育旺盛阶段的胚胎甲基化水平低于其它阶段，低水平的甲基化使得胚性愈伤组织有更多的基因开始活跃表达，因此，在体细胞胚胎诱导过程中，可以通过降低其甲基化程度，促进胚胎发生.

1.2 植物体细胞胚胎发生过程中的microRNA调控

microRNA(miRNA)作为基因表达的调控因子，在植物体细胞胚胎发生中发挥着重要的作用.目前的研究大多集中在差异表达miRNA的筛选、预测和鉴定方面[19-21].miRNA通常参与植物激素转导及抗病、非生物胁迫响应、种子萌发等生理发育相关过程[22]，随着基因组学分析技术的发展，miRNA在植物体细胞胚胎发生中的调控研究成为热点[23].

张守攻等[24]在日本落叶松(L.kaempferi)胚性和非胚性愈伤组织中发现4个miRNA家族165个miRNA差异表达，在胚性愈伤组织miRNA中有1个上调3个下调，即miRNA171上调表达，miRNA159、miRNA169和miRNA172下调表达；这4个家族均为非生物应激诱导的miRNA，并且3个表达下调的miRNA家族也受到ABA调控.Nodine et al[25]研究表明，miRNA156家族在拟南芥体胚发育过程中都丰富表达，在dcl1突变体胚胎中发现miRNA156抑制SPL基因的转录，并阻止了胚胎成熟期诱导基因转录本的过早积累，使体细胞胚胎维持在早期胚胎阶段，间接说明miRNA156能够参与调控胚状体形成.柑橘(Citrusreticulata)[26]体胚诱导初期，胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织中有大量的miRNA差异表达，分别为miRNA472、miRNA482与miRNA156、miRNA164、miRNA171c，表明miRNA在植物体细胞获得胚性能力的过程中发生作用.

Chávez-Hernández et al[27]研究了光照和激素在玉米(Zeamays)体细胞胚胎诱导过程中的作用，对特异性miRNA和靶基因进行检测发现，激素缺失对植物再生过程中特异性miRNA的表达有很大的影响，而不依赖于光.张静[28]在细叶百合(Liliumpumilum)和兰州百合(L.davidiivar.willmottiae)中筛选了24个miRNA和12个靶基因，miRNA和靶基因表达形式是反向关系.细叶百合miRNA394a和miRNA528a依次调控BGA6和SSG并影响发育过程中碳水化合物代谢；兰州百合中miRNA167、miRNA397和miRNA408调控靶基因WRKY和LAC，对胚性细胞分裂和细胞壁木质素合成起抑制作用；两种百合中的miRNA395和miRNA396通过对靶基因FtsZ和GRF进行调控参与体细胞的诱导和分化过程.

miRNA在众多植物体细胞胚胎发生和发育中具有重要意义，植物生长调节剂对体细胞发生过程中的特异性miRNA有较大的影响，并且miRNA可以通过对靶基因的调控来参与植物体细胞胚胎中发育相关过程，因此，在诱导胚性愈伤组织时，可通过调节培养基中植物生长调节剂的种类和浓度提高诱导率.

2 转录组学在植物体细胞胚胎研究中的应用

随着组学广泛地应用于植物研究，体胚发生相关基因的表达与调控也被应用于提升植物再生能力和遗传转化效率[29-30].其中转录组学已经被用于调控体细胞胚胎发育过程中关键基因的分离和验证研究.经过差异表达基因与数据库的比对，注释并获得相关基因或代谢通路，对于解析体胚发生机制起着关键作用.以转录组学为关键词在百度学术检索，发现在2010—2015年植物体胚的转录组学相关研究基本都在每年3 000篇以上，2015—2019年也维持在每年2 000篇以上.

2.1 转录组在鉴定差异基因方面的应用

植物体细胞胚胎发育一般会经历非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、不同时期胚状体，每个阶段都会有不同的相关基因调控其发育，运用转录组技术可以了解不同阶段基因的表达与调控.Che et al[31]对玉米杂交种Hi-Ⅱ愈伤组织和体细胞胚胎发育过程中的基因表达模式进行了研究，发现大量关于组蛋白和核糖体蛋白基因在体细胞胚成熟过程中表达量下降，而编码水解酶的基因和储藏基因在成熟过程中表达量上升，这与体胚成熟时期需要大量淀粉和可溶性蛋白提供营养物质和能量相符[32].这些基因可作为植物发育过程的标记基因，揭示玉米体胚在成熟过程中细胞增殖和生长的速度逐渐减慢的过程.刘蓓蓓和孙丽芳的研究也表明[33-34]，玉米胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织基因有显著的差异表达，鉴定到100多个基因差异表达，筛选出5个胚性愈伤组织发育相关候选基因.龙眼(Dimocarpuslongan)体细胞胚胎转录组数据分析表明[35]，生长素和细胞分裂素等激素信号途径在体胚发生过程中发挥重要调控作用，非胚性愈伤阶段有大量类黄酮合成基因，体胚发育早期存在大量脂肪酸合成基因，并克隆得到了开花时间相关的基因.许蓉蓉[36]对番木瓜(Caricapapaya)雌性和两性体细胞胚进行转录组分析发现，球形胚发育阶段的差异表达基因主要集中在细胞壁的形成过程；心形胚阶段的差异表达基因主要集中在物质和能量代谢通路；鱼雷胚阶段核小体和染色质的组装过程相关基因差异表达；子叶胚阶段的差异表达基因集中在细胞核内物质的形成、代谢过程以及分生过程的形成和分化，并明确了心形胚和鱼雷胚为体细胞胚胎发育的关键发育节点.

综上所述，体胚发育的各个时期均有大量差异表达基因参与调控，体细胞胚胎发育过程中并不是单独基因控制，而是受多个基因协调控制，可以通过调控各个阶段的丰富表达差异基因或特异性基因来加快体胚发育进程，以解决体胚发育进程难以统一的问题.

2.2 胁迫转录组在体细胞胚胎研究中的应用

胁迫是体胚发生的重要诱导因子，能够引起植物体细胞脱分化并诱导形成新的胚性细胞[37].植物体细胞胚胎诱导培养中，易受到多种胁迫因子的影响，如重金属，真菌，脱水，高温等，大量研究证实胁迫能够诱导体细胞获得胚性能力[38].胁迫诱导的植物体细胞胚胎发生源于基因表达模式的改变、细胞脱分化以及细胞胚性能力的获得[39].

Jin et al[40]对棉花不同时期胚状体进行NaCl和ABA胁迫处理，鉴定出大量差异表达的激素相关基因、激酶基因、编码转录因子的基因和下游应激反应基因，适当的胁迫可以促进体细胞胚胎的形成.程文瀚[41]在棉花体细胞胚胎中发现了一些与植物响应胁迫相关的基因和保护酶系统相关基因.为了验证胁迫与体胚之间的关系，对棉花体胚进行了干旱与盐胁迫，结果显示，适当的胁迫条件能促进棉花胚性愈伤组织的增殖，提高胚状体形成效率.潘笑[42]对甘草(Glycyrrhizauralensis)愈伤组织进行盐胁迫处理，发现SOS信号途径、MAPK信号途径、转录因子和激素代谢等途径中的相关基因相互作用共同调控，维持细胞离子平衡、氧化还原平衡和渗透平衡，提高了细胞盐耐受性.尹玢[43]对毛白杨(Populustomentosa)悬浮细胞进行氧化胁迫处理，分析得到了806个显著差异表达基因，涉及细胞分裂、细胞分裂素的激活、赤霉素调控以及磷酸化途径.

综上可以看出，植物体细胞内存在大量与胁迫相关的基因，适当的胁迫可以使促进愈伤组织的诱导和体胚的形成，在植物体细胞受到胁迫影响时，会有大量差异表达基因和通路协同调控，使植物体细胞维持稳定状态.这些研究为我们提供了新的思路，可以在植物体细胞胚胎发生过程中进行适当的胁迫，有助于胚性愈伤组织的形成和分化.

3 蛋白组学在植物体细胞胚胎研究中的应用

目前，已经挖掘出大量与体细胞胚胎发生相关的基因，而蛋白质是基因表达的产物，是生命活动的直接展示者.对体胚蛋白组学的研究，有助于对植物体细胞胚胎形成的不同阶段中差异蛋白进行分析，进一步揭示植物体细胞胚胎发生机制.以蛋白组学为关键词在百度学术检索，发现蛋白组学应用于植物体细胞胚胎研究的文献，2010—2012年每年约3 000篇，2014—2019年每年1 000篇以上.

Zhao et al[44]在落叶松体细胞原胚、球形胚、子叶胚中共鉴定出503个蛋白，其中96个蛋白在不同发育阶段存在差异；功能分析显示，参与初级代谢、磷酸化和氧化还原的蛋白在体细胞胚胎发育过程中上调.Alexandra et al[45]鉴定出可可树(Theobromacacao)正常成熟体细胞胚的两种形态类型，即白色外观和透明外观的体胚.在白色体细胞胚中，至少有60种蛋白质的丰度水平与透半明体胚相比存在差异.在白色体细胞胚中观察到β-葡萄糖苷酶、NAD(P)连接氧化还原酶和电子转移黄素蛋白的丰富度增加.此外，在透明的体细胞胚胎中观察到细胞色素P450和病原相关蛋白的丰度增加.Guo et al[46]对棉花非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、球形胚的蛋白表达动态进行了研究，共鉴定出9 369个蛋白，过氧化物酶、光合作用、环境胁迫反应过程、氮代谢、激素反应/信号转导、转录/转录后和修饰参与了体细胞胚胎的发生.

植物体细胞胚胎经过非生物胁迫时，大量具有保护作用的蛋白家族上调表达.Businge et al[47]研究表明，蔗糖处理的冷杉(Abiesfabri)体胚中LEA含量显著增高，3%蔗糖处理体胚后显著地提高了体胚萌发率.Alexandre et al[48]对海岸松(P.pinaster)体胚添加结冷胶控制水分利用率，鉴定出83个差异位点，注释位点大多数集中在代谢过程、细胞过程和对刺激的反应进程中，胚状蛋白和泛素蛋白连接酶可以作为体胚发生的预测标记，处理后的体胚SOD和PDI含量增高.大部分蛋白在体细胞胚胎发育成熟时期上调，杂种落叶松[49]未成熟胚胎与成熟胚胎中21种被注释为热休克蛋白的蛋白质差异表达，在冷杉成熟体胚中同样检测到高表达的热休克蛋白与小热休克蛋白[47].因此热休克蛋白可以作为胚胎成熟时期的特异性蛋白.现在已经知道多种蛋白参与体细胞胚的发育，这些蛋白在体细胞胚胎发育过程中的表达量变化比较大，可以确定明显变化的蛋白对体细胞胚的分化具有重要意义.阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)[50]、非特异性脂质转移蛋白(nsLTPs)[51]以及萌发相关蛋白(GLPs)[52]已经被认为是体胚发育过程中的标记蛋白.

综上所述，不同蛋白质的动态表达，构成复杂的生物活性调控网络，促进植物体细胞胚胎的全能性.植物体细胞胚胎发育过程中，特异性标记蛋白可以用来鉴定培养过程中不容易发现的胚性物质，同时确定和监控胚胎发育的不同阶段，因此特异性标记蛋白的研究可以进一步了解体细胞胚胎发生相关基因的表达规律，对植物体细胞胚胎研究具有重要意义.

4 代谢组学在植物体细胞胚胎研究中的应用

代谢组学是一项继基因组、转录组、蛋白组学之后探索生物功能的重要新手段，可以从整体了解生物体内代谢物的浓度或代谢流的变化，进而辅助研究基因表达和蛋白定量[53].

Robinson et al[54]对火炬松(P.taeda)愈伤组织的代谢组成、生理状态、基因型以及胚性能力之间的相互关系进行研究，发现了与胚产量相关的代谢物有47种，并建立模型解释了在培养过程中体胚失去再生能力的原因.Businge et al[55]在欧洲云杉(P.abies)体细胞胚胎培养中，发现体胚诱导阶段糖信号发挥作用，并且得出结论：生长素对愈伤组织生长和体细胞的分化有重要作用.李粉青[56]用2.5、3.6、5.0 μmol·L-1的6-BAP处理川西云杉(P.balfouriana)愈伤组织，发现降低6-BAP的浓度会使色氨酸含量降低，从而提高组织中IAA的含量，提高其胚胎发生能力；并且天门冬酰胺、丝氨酸、色氨酸等可以认为是胚性能力的标记代谢物.Iqbal et al[57]对甘蔗(Saccharumofficinarum)胚性和非胚性愈伤组织分析表明，葡萄糖、果糖、蔗糖和丙氨酸在胚性愈伤组织中含量较高.

上述可以看出，糖信号在体细胞胚胎发生中发挥关键性作用，可以通过调控外源生长素来促进体细胞胚胎的发生.

5 展望

植物体细胞胚胎培养已经在工厂化育苗、拯救濒危植物、生产人工种子等方面展现出良好的应用前景.虽然在这方面已经取得了很大成就，但对于很多植物来说，体细胞胚胎发生仍处于不成熟阶段.目前，植物体细胞胚胎发生发育的分子调控机理还不清晰，难以控制体细胞胚胎的发育过程，使其在工厂化育苗应用中受阻，如在体细胞胚胎培养中不能完全解决胚性愈伤组织诱导率低、褐化现象严重、体胚发育进程难以统一、转化为活苗的体胚数量少、再生植株生长较弱等问题.因此，将组学技术应用于植物体细胞胚胎研究中，在基因表观修饰基础上结合结构基因组学、功能基因组学和宏基因组学等先进技术，揭示体细胞胚胎发生的分子机理；运用转录组数据挖掘大量差异表达基因，筛选克隆关键基因，并运用基因敲除、过表达等手段鉴定未知功能基因，应用于体细胞培养生产实践中，实现精准调控体胚发生发育过程.通过对发育过程中特异性蛋白的鉴定，结合转录组数据，揭示相关调控基因在复制、转录、翻译过程中的特异表达，明确体细胞胚胎发育过程中相关基因的表达规律，以及对体胚表型发育的影响，有助于更好的对体胚发育进行调控.相对于其他3种组学，代谢组应用时间相对较晚，通过比较不同发育时期，不同处理下植物体细胞胚胎的合成及代谢物，并标记体胚不同发育过程中的特异代谢物，探究植物体细胞发育过程中代谢物的变化以及对发育过程产生的影响.目前大多以单一组学方法应用于植物体细胞胚胎发生发育研究，解释各自水平上的调控机理，未来的研究将是多组学联合应用，进行关联分析，系统解析基因、RNA、蛋白质和小分子间的相互作用和调控机制，更深入地揭示植物体细胞胚胎发生发育机理，破解体细胞胚胎培养中的各种难题，使植物体细胞胚胎培养在工厂化育苗中得到广泛应用.