miR-765通过调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展

龙石峰　龙生平　贺红蕾

摘要：目的：探讨miR-765对线粒体自噬发生的调控关系，以及对多发性骨髓瘤的发生发展的影响。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ-PCR）及蛋白质印迹western bot试验技术测定靶基因及靶自噬关键蛋白的准确含量。结果：多发性骨髓瘤患者化疗前miR-765及自噬关键蛋白表达水平变化均显著高于正常对照（P<0.05），miR-765和自噬关键蛋白表达水平变化具有正相关性。结论：miR-765可以调控线粒体自噬的发生，而通过调控线粒体自噬的发生进一步影响多发性骨髓瘤的发生和发展。

关键词：线粒体自噬;多发性骨髓瘤;蛋白质印迹试验western bot

【中图分类号】R730.4             【文獻标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）12--02

引言

多发性骨髓瘤是一种以骨髓浆细胞恶性克隆性增殖为特征的B淋巴细胞恶性肿瘤，与骨髓基质细胞密切相关 - 。其自分泌或旁分泌可溶性细胞，这些细胞分泌细胞因子调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展 -  。细胞因子中即包括miR-765蛋白，其为TNF家族新成员，因具有促进肿瘤细胞增殖作用而命名，为幼稚、原始及活化B淋巴细胞的主要调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展因子之一。

Western Blot它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种蛋白质印迹法实验方法。现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

在多发性骨髓瘤细胞受外源性调控线粒体自噬激活的各种信号途径中，NF-кB 途径可能是最主要的途径之一。目前研究已证实，能直接激活NF-кB途径的miR-765，已经被确认是多发性骨髓瘤细胞的主要存活调控线粒体自噬的发展发生促进多发性骨髓瘤的发生因子及生长调控线粒体自噬的发展发生促进多发性骨髓瘤的发生因子，骨髓瘤细胞系及幼稚骨髓瘤细胞高表达miR-765。miR-765被发现具有保护多发性骨髓瘤、B-CLL细胞避免自发性凋亡及药物诱导性凋亡作用，同时可提高其细胞存活能力。故目前认为，对miR-765的研究极有可能成为肿瘤，尤其是B淋巴细胞恶性肿瘤研究的新方向。

本研究采用RFQ-PCR及western bot试验技术，测定不同分期多发性骨髓瘤首次就诊及应用一周期VAD方案化疗后患者外周血血浆中自噬关键蛋白及单个核细胞中miR-765的表达发展情况，并归纳总结miR-765表达发展与多发性骨髓瘤不同分期及化疗前后间的关系，以期在多发性骨髓瘤早期诊断、早期治疗、预测疾病活动以及寻找预后生物参数等方面发挥重要作用，并为临床治疗新方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

62份标本均取自井冈山大学附属医院血液科2020年4月～2021年5月住院的31例初诊及一周期VAD方案化疗后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年龄65岁（46～82岁）。多发性骨髓瘤 Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A组12例，B组19例。15份健康供者标本，中位年龄69岁（55～80岁）。多发性骨髓瘤分型、疗效标准及疾病诊断采用《血液病诊断及疗效标准》，由张之南主编。多发性骨髓瘤分期按国际分期系统（ISS）进行。

1.2 western bot（蛋白质印迹法）材料

限制性内切酶、T4 DNA连接酶; pGEM-T载体试剂盒;Trizol 试剂;X-gal、Taq DNA聚合酶;逆转录试剂盒（Qiagen公司）;DL-2000;胶回收试剂盒;ELISA试剂盒、自噬关键蛋白紫外分析仪、荧光定量PCR仪、全自动酶标仪。

1.3 western bot试验（蛋白质印迹法）

1.3.1制备标本

取化疗前及后患者外周血6 mL，应用EDTA抗凝， 2 mL提取血浆，4 mL分离出单个核细胞。

1.3.2设计探针及引物

据注册号为NM012512的自噬关键蛋白（Pink1，parkin NIX） 全序列（内参）和miR-765 （注册号为AF04688 ），设计相应引物和荧光探针并合成。

1.3.3 构建调控线粒体自噬基因（miR-765）及内参β-ACTIN及自噬关键蛋白（Pink1，parkin NIX）标准品

细胞总RNA经Trizol法提取后检测其浓度和纯度，并进行逆转录反应， cDNA进行扩增目的片段，胶回收电泳PCR产物与T载体连接，连接产物经过蓝白斑western bot试验筛选出重组质粒，提取出小量，阳性克隆经EcoRⅠ酶切western bot试验鉴定、测序分析证实后进一步扩增，质粒抽提，再经自噬关键蛋白紫外分析仪定量，按倍比稀释后保存。

1.3.4 RFQ-PCR检测miR-765含量

在离心管中加入反应体系，并设5个miR-765标准品、空白管及阴性管各3个复孔作为对照。PCR 扩增在荧光定量检测仪中进行。由电脑软件计算出标本中miR-765值， 将miR-765与Pink1，parkin NIX比值定为评估miR-765表达水平变化的标值。

1.3.5  western bot方法检测自噬关键蛋白含量

western bot方法检测自噬关键蛋白（Pink1，parkin NIX）含量，严格按照说明书执行，测定靶自噬关键蛋白含量。

1.4 统计学处理

采用Stata7.0统计学软件进行数据处理。数据以均数±标准差（）表示，正常对照及多发性骨髓瘤患者化疗前不同分期、多发性骨髓瘤患者化疗后不同疗效miR-765和自噬关键蛋白的表达发展比较均采用单因素方差分析，如差异有统计学实际实践的价值，进一步两两比较采用Scheffe法，P<0.05。

2 结果

2.1 总RNA的纯度和质量

细胞总RNA检测表明，提示质量及完整性均良好。

2.2 PCR扩增产物电泳检测

扩增产物经电泳检测， 结果表明片段大小符合预期值。

2.3 western bot试验鉴定阳性克隆

将蓝白斑western bot试验筛选出的重组质粒， 抽提出小量，EcoRⅠ内切酶，western bot试验鉴定阳性克隆后测序分析，显示与Pink1，parkin NIX及miR-765的基因序列相符，同源性达100%。

2.4 ELISA检测的线性关系

miR-765标准品经酶标仪测定OD值，得出标准曲线，显示不同标准品浓度与相应OD值之间存在良好的线性相关（r=1%）。

2.5 基因miR-765通过调控线粒体自噬及自噬关键蛋白测定结果

结果表明：对照组与多发性骨髓瘤患者化疗前各期miR-765及自噬关键蛋白表达发展均采用单因素方差分析比较有统计学差异（miR-765 F=4.28，P=0.0275; miR-765自噬关键蛋白F=5.11，P=0.0157），Scheffe法进一步两两比较显示：各期miR-765及自噬关键蛋白水平均显著高于正常对照（P<0.05）

3 讨论

在过去的几年中，努力寻找识别多发性骨髓瘤高危人群的预后指标及明确促进多发性骨髓瘤细胞恶性增殖及耐药发生的一系列复杂机制的研究已大量开展，最近研究显示，miR-765在B细胞的生成、免疫耐受及恶性克隆性增殖等方面均发挥重要作用。在正常生理状态下，miR-765是骨髓中浆细胞不可缺少的调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发展发生因子。研究显示，分泌大量miR-765的巨核细胞，对浆细胞而言是必不可少的骨髓组成部分，间接表明浆细胞存活有赖于miR-765。这些选择性局灶性分泌的miR-765可能对骨髓中淋巴系统恶性肿瘤的存活起至关重要的作用。多项研究已证实miR-765在肿瘤疾病中发挥重要作用，尤其是B细胞恶性肿瘤。人miR-765 转染的小鼠，大约40%最终发展为类似于B-CLL的B细胞恶性肿瘤。

在我們的研究中发现，多发性骨髓瘤患者miR-765血清自噬关键蛋白表达水平变化明显高于正常对照，与文献报道相一致，且miR-765表达发展与自噬关键蛋白水平表达发展一致。更重要的是，我们证实，多发性骨髓瘤分期越高，其miR-765及自噬关键蛋白表达表达水平变化越高，Ⅲ期明显高于Ⅰ期及Ⅱ期，化疗后表达表达水平变化下降，与文献报道相一致，具体数据另篇论文详细叙述。我们进一步将化疗后不同疗效进行比较发现，PD组显著高于CR及PR组（P<0.05）。

主要数据分析表明，miR756的表达水平的变化和线粒体自噬蛋白水平变化有明显相关性，miR756能调控线粒体自噬，通过调控线粒体自噬影响多发性骨髓的发生和发展，分析与研究体现miR756，自噬，多发性骨髓瘤三者间的关系。

在本研究中，患者中 血清 miR-765表达水平显著低于对照组，且ISS分期Ⅲ期患者显著低于I/Ⅱ期患者（P<0.05），此外 miR-765的表达水平与多发性骨髓瘤的髓外浸润相关 [10]（P<0.05）。miR-765位于人类染色体17pl31，在几乎所有人体器官和组织中均有表达. 例如大脑、乳腺、肺、胃和血液等 。目前已有大量的研究指出 miR-765 在多种肿瘤类型中的处于失常的状态，从而促进肿瘤疾病进程发展 。例如，Han等人发现，在 ERα阴性乳腺癌中，miR-765的表达量降低通过增加的 MIF表达和增强 患者P9 活性，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。Zhang 等1n报道，miR-765通过直接靶向 E2F3基因抑制人膀胱癌移行细胞的增殖、迁移和侵袭。Ge 等报道，在骨肉瘤细胞中miR-765过表达能够抑制细胞增殖，克隆形成，迁移和侵袭，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞。并且在裸鼠模型中miR-765的过表达能够抑刺肿瘤生长。提示miR-765与肿瘤患者疾病进程显著相关，可能可以用于肿瘤患者的诊断或早期诊断。

图2 miR-765表达水平与无事件生存期之间的关系

ROC曲线分析结果指出，miR-765 的表达含量对 患者 患者和对照组的签别能力良好，miR-765的曲线下面积（AUC）为0.9333，触感性为86%，特异性为96%，95%置信区间（CI）0. 886-0.981∶P<0.0017。此外，20个月的随访指出，miR-765低表达组的无事件生存期显著高于miR-765 高表达组。指出 血清中 miR-765的表达水平与患者的预后相关。总之，本研究表明血清中 miR-765 的表达水平可用作生物标志物帮助 患者中的诊断和预测。miR-765 可用于鉴定预后不良的患者，有助于及时选择合适的治疗方案。

结论：

综上所述，我们的结果已显示，miR-765及自噬关键蛋白表达水平是提示多发性骨髓瘤疾病发生和进展的有重要意义的生物学指标。miR-765表达水平变化是调控线粒体自噬的发生促进多发性骨髓瘤的发生发展的重要因素。miR-765水平检测可以作为多发性骨髓瘤的诊断、早期治疗及预后的新指标，且可能成为有效治疗的新靶点。

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作者簡介：第一作者，姓名：龙石峰，职称：副主任医师 科室：血液科，出生年月：1975-11-20，井冈山大学附属医院343000。