河南省部分城市宠物犬芽囊原虫的感染情况调查

陈 益 ， 贺桂芬 ， 夏艳勋 ， 王海燕 ， 裴雅琦

(河南牧业经济学院 ， 河南 郑州 450046)

芽囊原虫是一种常见的、可引起动物和人腹泻的胃肠道寄生性原虫。宿主范围广泛，包括人类、非人灵长类动物、伴侣动物、反刍动物、鸟类和野生哺乳动物[1]。芽囊原虫可通过直接接触或吃入受污染的水和食物感染，通过粪-口传播方式进行传播[2]。芽囊原虫常与胃肠道疾病有关，例如自限性腹泻、腹痛、肠应激综合征、胀气和荨麻疹[3-4]。犬是与人类密切接触的伴侣动物，最可能成为人类芽囊原虫感染的潜在传染源。世界各地均有人、犬同时检出相同芽囊原虫亚型的报道，如在澳大利亚，人与犬共同感染ST1、ST3和ST4亚型 ； 在菲律宾，人、犬同感染ST1～ST5亚型； 在土耳其，人、犬同感染ST1～ST3亚型[5-6]。这些研究表明，犬可能是芽囊原虫的保虫宿主，在其传播给人类的途径中起着重要的作用。目前，关于中国犬芽囊原虫感染情况和STs亚型分布信息较少[7]，因此，本试验旨在调查河南部分城市犬芽囊原虫的感染情况及亚型分布特征，为评估其人兽共患性及公共卫生学意义提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2018年11月—2019年4月，分别从郑州、洛阳、开封、新乡、焦作5个地区动物医院采集236份宠物犬新鲜粪便，详细来源见表1。粪样分装于自封袋中，标注犬地区、年龄、采集时间等相关信息，置放有冰袋的泡沫盒中运输，然后置4 ℃冰箱中待检。

表1 犬粪便样品信息Talbe 1 Information of canine fecal sample

1.2 主要试剂 基因组E.Z.N.A.®Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc.,Norcross,USA)；TaKaRaTaq、琼脂糖、6×Loading Buffer、DNA marker DL-2 000[宝生物工程(大连)有限公司]；GelRedTM核酸染料(Biotium Inc.,Hayward，CA)；其他常用试剂。

1.3 主要仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)；Arktik 型PCR(Techgene，英国)；微量移液器、Alphalmager HP型紫外凝胶成像系统(Thermo公司，美国)；HH-2恒温水浴锅(常州华奥器械公司)；LDZX型高压灭菌器、电热恒温培养箱(上海跃进医用器械厂)；SHA-C数显恒温振荡水浴锅(金坛恒丰器械厂)；DYCZ-Ш28A型电泳槽；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；高速离心机(Eppendorf，德国)；低速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 粪便基因组DNA提取 取200～300 mg新鲜粪便样品置1.5 mL离心管中，加入1 mL灭菌蒸馏水，3 500 r/min离心10 min，反复洗涤3次，直至上清无色透明。之后按试剂盒(OmegaBio-tek)说明书操作，将提取的DNA置-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 犬芽囊原虫小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因扩增 按照Scicluna等[8]设计引物，F-RD5:5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，R-RD3:5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，预计产物片段为520 bp。每组PCR反应均设阳性对照(奶牛芽囊原虫分离株)、阴性对照(蒸馏水)。配制25 μL体系：双蒸水19.05 μL，10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/ L) 0.5 μL，上游引物(RD5) 0.4 μL，下游引物(RD3)0.4 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.15 μL，模板DNA 2 μL。犬芽囊原虫SSU rRNA基因扩增程序：94 ℃预变性7 min；93 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反应35个 循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测及序列测定、分析 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外凝胶成像仪下观察。将阳性产物送北京诺赛公司进行双向测序，用Clustal X 2.3.3将反向测序得到的序列反转互补后与正向测序序列进行手动比对截齐，获得校正序列，将校准后的序列在NCBI的BLAST上进行检索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，确定序列是否为芽囊原虫基因序列。

1.4.4 种系发育系统进化树的构建 基于MEGA 7.0(http://www.megasoftware.net)软件，采用邻接(Neighbor joining, NJ)法(自展值为1 000、Kimura-2参数模型)，基于SSU rRNA基因位点构建种系发育系统进化树。

2 结果

2.1 感染情况 236 份宠物犬粪样基因组DNA 扩增后，5份样品在500～750 bp出现特异条带，与预期片段大小相符(图1)，总感染率为2.1%(5/236)。其中洛阳市、郑州市和焦作市的宠物犬中检出芽囊原虫，感染率分别为2.1%(1/48)、3.0%(2/67)和3.4%(2/59)，开封和新乡两地未检出(表2)。

图1 犬粪便中芽囊原虫SSU rRNA基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of Blastocystis SSU rRNA gene in canine fecesM：DNA标准DL-2 000； 1：阴性对照； 2：阳性对照； 3～7：粪便样品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3-7:Faecal samples

将宠物犬分为不同的年龄组，≤6月龄犬(n=129)和>6月龄犬(n=107)。结果发现，宠物犬芽囊原虫阳性样品均来自6月龄以下的犬，感染率为3.8%(5/129)，6月龄以上的犬未见感染。见表2。

表2 各地犬芽囊原虫检出情况统计Table 2 Statistics of canine Blastocystis detection in some cities of Henan

2.2 亚型分布情况 基因公司测序校正后获得2个不同的序列，序列1(命名为Henan-dog-1，n=1)和序列2(命名为Henan-dog-2，n=4)，比对发现2个序列分别与英国山羊源分离株(序列号:MF186699)和中国人源(序列号:MK898940)分离株同源性100%。

基于SSU rRNA基因进行的种系发育系统进化树分析发现，2个不同的基因序列与GenBank数据库中芽囊原虫ST1亚型位于同一进化支上，见图2。研究结果表明，该地区宠物犬共检测到1种芽囊原虫基因型，为ST1亚型。

图2 基于SSU rRNA基因位点的芽囊原虫亚型邻接法(NJ)系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree with neighbor joining (NJ) subtype based on SSU rRNA gene of Blastocystis▲: 本试验所得序列▲: Sequences in the present study

3 讨论

世界各地范围内都有犬芽囊原虫感染的报道,如美国太平洋西北部流浪犬的感染率为9.7%(10/103)[9]，菲律宾一城市社区宠物犬的感染率为15.8%(23/145)[10]，澳大利亚宠物犬的感染率为2.5%(2/80)，哥伦比亚半家养犬的感染率为1.3%(1/80)，印度流浪犬的感染率为24%(19/80)[11]，巴西家养犬的感染率为2.6%(2/78)[12]，法国家养犬的感染率为3.4%(4/116)[13]，而哥伦比亚家养犬的感染率高达37.5%(15/40)[14]。我国关于犬芽囊原虫感染报告较少，只有中国东北地区(黑龙江、吉林和辽宁)家养犬的感染率为2.9%[7]，安徽滁州、合肥犬感染率分别为3.4%和5.6%[15]。本次调查发现，河南部分城市宠物犬芽囊原虫感染率为2.1%，低于上述报道。造成芽囊原虫感染差异性的因素很多，包括不同的样本量、犬生活的卫生条件、检测方法、季节、年龄和地理环境等。

基于小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因的系统进化分析，芽囊原虫存在广泛的基因内变异，目前，已检测出17个不同的亚型(STs)[16]。其中ST1～ST9和ST12在人类中发现，以ST3为主，其次为ST1[17]，而ST10、ST11和ST13～ST17只感染动物[18]。然而，在动物体内不断发现可感染人类的基因亚型，如在灵长类(ST1)、猪(ST1、ST3、ST5)、猴(ST2)、犬(ST1～ST4、ST6)、牛(ST4、ST6)、羊(ST5)、牛(ST6)以及鸟(ST7)[19-23 ]。此外，一些研究表明，人类与接触动物之间存在高度相似甚至完全相同的基因亚型，这提示了芽囊原虫的人兽共患性[21,24-25]。最近的研究表明，芽囊原虫不同的基因亚型可能有不同的致病性，例如ST1和 ST3常在有症状的患者中出现，更有可能对人类具有致病性，其余STs亚型可能对人类无明显致病性。本次从236份宠物犬粪便中检出5份ST1亚型，表明河南省部分地区存在芽囊原虫人—犬共患风险，具有重要的公共卫生学意义。