基于TLR2/4-NF-κB信号通路研究刺五加多糖对鸡淋巴细胞的调节作用

张英楠 ， 张桂山 ， 徐 晶 , 杨树宝,4

(1. 长春科技学院生命科学学院 ， 吉林 长春 130600 ； 2. 吉林医药学院公共卫生学院 ， 吉林 吉林 132013 ； 3. 吉林医药学院基础医学院 ， 吉林 吉林 132013 ； 4. 吉林农业大学动物科技学院 ， 吉林 长春 130118)

近年来，关于各种多糖对动物免疫调节的研究很多，但大多数只是对一些免疫指标(如抗体效价、免疫器官指数、淋巴细胞增殖功能等)进行检测，而对多糖具体通过什么途径来影响免疫细胞及免疫分子的增殖、分化和分泌等，即多糖调控免疫活性的机制具体是什么还了解较少。但是最近几年，随着细胞和分子手段的不断应用，许多学者也对多糖的免疫调节机理进行了探索，并得到了一些突破性的成果。目前，研究最为透彻的即为Toll样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路，它的发现对于揭示多糖免疫机制具有重要意义[1-2]。研究发现在细胞表面存在多种多糖作用受体，如 TLR2、TLR4等，多糖可以通过与这些受体结合，激活细胞内信号通路，活化NF-κB，促进免疫细胞增殖，诱导细胞因子的释放，进而发挥免疫调节作用，因此目前被认为最经典的多糖免疫调节通路为TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，一些学者也尝试利用TLR2、TLR4抗体以及NF-κB阻断剂PDTC等阻断此条信号通路的刺激信号传输[3-4]，从而研究多糖的免疫调节机制。

本课题组前期研究表明，刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)具有促进免疫器官及黏膜淋巴组织发育、淋巴细胞定位分布、血液中CD4+T淋巴细胞数量、淋巴细胞增殖功能、抗体效价、细胞因子分泌等免疫调节作用，Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2促进血液中CD4+T淋巴细胞含量、Th2类细胞因子IL-4和IL-10抑制Th1类细胞活性并增加抗体产生等[5-6]，但是关于具体的作用机制还有待于进一步发掘和探究。因此，本试验结合经典的信号通路TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，以鸡血液淋巴细胞为研究对象，观察用 TLR2 和TLR4抗体和 NF-κB阻断剂PDTC处理鸡外周血淋巴细胞后，各种细胞因子mRNA 表达量的变化，探究可能的信号通路，从而初步揭示ASPS的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10只30日龄健康海兰褐蛋鸡，购自长春市农业科学研究院种鸡场。

1.2 主要试剂 刺五加多糖由本实验室提取和纯化，多糖纯度为 81%。肝素钠、RPMI-1640培养液，均购自鼎国生物技术公司；胎牛血清，购自美国Gibco；叠氮钠，购自北京化工；淋巴细胞分离液，购自灏洋生物制品公司；红细胞裂解液，购自碧云天生物技术研究所；总RNA提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix，均购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (DRR047A)、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，均购自宝生物工程(大连)有限公司；TLR2和TLR4抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司；PDTC，购自Sigma公司。

1.3 主要仪器 冷冻离心机5424R，Eppendorf公司；水平离心机,Fastwin公司；12孔细胞培养板，德国Greiner Bio-One公司；ABI StepOneTM实时荧光定量PCR仪。

1.4 方法 将分离得到的淋巴细胞悬液加入12孔细胞培养板中，每孔加入500 μL，在不同孔中分别加入终浓度为20 μg/mL的TLR2和TLR4抗体以及10 μmol/L的PDTC，培养1 h，然后加入200 μL终浓度200 μg/mL ASPS进行培养。另设不加任何处理的空白对照组和只加200 μg/mL ASPS的ASPS处理组。39.5 ℃、5%CO2培养箱培养24 h后，取细胞上清液，收集淋巴细胞，进行总RNA提取和反转录，并对IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α等细胞因子的mRNA表达水平进行荧光定量PCR检测。引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于实时荧光定量PCR扩增的鸡细胞因子引物Table 1 Primers used for the real-time fluorescence quantitative PCR amplification of chicken cytokines

1.5 数据分析 将得到各样品的平均Ct值采用ΔΔCt法进行计算分析，公式为2-ΔΔCt。各组均以12 h 空白组为样本对照，计算其他各试验组相对于12 h空白组的表达量倍数，试验数据以Means±SD 表示，SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan’s 法进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 ASPS对TLR2和TLR4抗体阻断的淋巴细胞的细胞因子mRNA表达水平的影响 结果如图1A所示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-2 mRNA相对表达量显著增加，约是空白对照组的6倍左右。应用TLR2抗体和ASPS共处理(TLR2+ASPS组)后，IL-2 mRNA表达量并未明显下降，与ASPS处理组相近。而TLR4抗体和ASPS共处理(TLR4+ASPS组)后，IL-2 mRNA表达量明显下降，但下降幅度较小，仍显著高于空白对照组(P<0.05)。表明TLR2抗体不能阻断淋巴细胞IL-2 mRNA的表达，而TLR4抗体可以部分阻断淋巴细胞IL-2 mRNA的表达。

图1B显示，与IL-2相似，ASPS处理组淋巴细胞中IFN-γmRNA相对表达量显著增加。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，IFN-γmRNA表达量并未下降，与ASPS处理组相近。而TLR4抗体和ASPS共处理后，IFN-γmRNA表达量明显下降，仍显著高于空白对照组(P<0.05)。表明TLR2抗体不能阻断淋巴细胞IFN-γmRNA的表达，而TLR4抗体可以部分阻断淋巴细胞IFN-γmRNA的表达。

图1C显示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-4 mRNA 相对表达量并未显著增加，与空白对照组比较差异不显著(P>0.05)。分别应用TLR2 和TLR4抗体与ASPS共处理后，IL-4 mRNA表达量并无明显变化(P>0.05)。说明TLR2和TLR4抗体对阻断淋巴细胞IL-4 mRNA的表达无影响。

图1D显示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-10 mRNA相对表达量显著增加。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，IL-10 mRNA表达量并未下降，与ASPS处理组相近。而TLR4抗体和ASPS共处理后，IL-10 mRNA表达量显著下降，并且与空白对照组差异不显著(P>0.05)。表明TLR2抗体不能阻断淋巴细胞IL-10 mRNA的表达，而TLR4抗体可以完全阻断淋巴细胞IL-10 mRNA的表达。

图1E显示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-1βmRNA相对表达量显著增加。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，IL-1βmRNA表达量显著下降，与空白对照组差异不显著(P>0.05)。而TLR4抗体和ASPS共处理后，IL-1βmRNA表达量并未下降，与ASPS处理组相近。表明TLR2抗体能够完全阻断淋巴细胞IL-1βmRNA的表达，而TLR4抗体则不能阻断淋巴细胞IL-1βmRNA的表达。

图1F显示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-6 mRNA相对表达量显著增加。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，IL-6 mRNA表达量略有下降，与ASPS处理组差异不显著(P>0.05)。而TLR4抗体和ASPS共处理后，IL-6 mRNA表达量显著下降，但同时仍显著高于空白对照组(P<0.05)。表明TLR2抗体不能阻断淋巴细胞IL-6 mRNA的表达，而TLR4抗体可以部分阻断淋巴细胞IL-6 mRNA的表达。

图1G显示，ASPS处理组淋巴细胞中iNOSmRNA相对表达量显著增加，而且增加幅度较大，为空白对照的6倍左右。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，iNOSmRNA表达量显著下降，介于ASPS处理组和空白对照组之间。而TLR4抗体和ASPS共处理后，iNOSmRNA表达量显著下降，并且与空白对照组差异不显著(P>0.05)。表明TLR2抗体可以部分阻断淋巴细胞iNOSmRNA的表达，而TLR4抗体可以完全阻断淋巴细胞IL-10 mRNA的表达。

图1H显示，ASPS处理组淋巴细胞中TNF-αmRNA相对表达量显著增加。应用TLR2抗体和ASPS共处理后，TNF-αmRNA表达量显著下降，但仍显著高于空白对照组(P<0.05)。而TLR4抗体和ASPS共处理后，TNF-αmRNA表达量显著下降，并且与空白对照组差异不显著(P>0.05)。表明TLR2抗体可以部分阻断淋巴细胞TNF-αmRNA的表达，而TLR4抗体可以完全阻断淋巴细胞TNF-αmRNA的表达。

图1 ASPS对TLR2和TLR4抗体阻断的淋巴细胞细胞因子mRNA相对表达量的影响Fig.1 Effects of ASPS on cytokines mRNA relative expression level of lymphocytes that TLR2 and TLR4 antibodies blocked肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05); 下同Different letters on the shoulder mark indicated significant difference (P<0.05),while the same letters on the shoulder mark indicated no significant difference (P>0.05). The same as below

2.2 ASPS对PDTC阻断的外周血淋巴细胞的细胞因子mRNA表达水平的影响 结果如图2所示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-2、IFN-γ和IL-10 mRNA相对表达量显著增加，均显著高于空白对照组(P<0.05)，而IL-4无明显变化。应用PDTC和ASPS共处理后，IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA表达量无明显下降，与ASPS处理组差异不显著(P>0.05)，但是IL-10 mRNA表达量却显著下降，接近空白对照组。表明PDTC对阻断淋巴细胞IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA 的表达没有作用，但可以显著阻断IL-10 mRNA 的表达。

图2 ASPS对PDTC阻断的血淋巴细胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表达水平的影响Fig.2 Effects of ASPS on IL-2，IFN-γ,IL-4 and IL-10 mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

如图3所示，ASPS处理组淋巴细胞中IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA相对表达量显著增加，均显著高于空白对照组(P<0.05)。应用PDTC和ASPS共处理后，IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表达量显著下降，并接近空白对照组，IL-6也有所下降，但是与ASPS处理组差异不显著(P>0.05)。表明PDTC对阻断淋巴细胞IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表达的作用十分显著，但并不能完全阻断，另外对IL-6 mRNA表达的阻断作用较小。

图3 ASPS对PDTC阻断的血淋巴细胞IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of ASPS on IL-1β,IL-6，iNOS and TNF-α mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

3 讨论

多糖通过复杂的信号转导途径刺激淋巴细胞免疫应答，其信号通路的研究存在一定的经验性和复制性。目前,推导多糖刺激淋巴细胞免疫信号通路的方法主要是通过已知受体的抗体或已知激酶的抑制剂来阻断细胞信号转导,从而推测该受体或激酶是否参与多糖的免疫调控过程。TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB是目前已知的最为经典的多糖免疫调节信号通路，很多学者对不同多糖针对这一通路进行了验证[7-12]，并证实其普遍的适用性。因此本试验应用TLR2抗体、TLR4抗体和NF-κB阻断剂PDTC分别与ASPS共处理淋巴细胞，观察对细胞因子mRNA表达的阻断效果，从而确定各种细胞因子的产生与此通路的关系。

本试验发现，TLR2抗体能够完全阻断IL-1βmRNA的表达，并且PDTC也能显著阻断IL-1βmRNA的表达，由于IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，而且TLR2是巨噬细胞上的重要Toll样受体，另外由于PDTC也能显著阻断IL-1βmRNA的表达，因此ASPS对巨噬细胞刺激产生IL-1β的机制可能为：ASPS可以与巨噬细胞上的TLR2受体结合，经TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB通路活化NF-κB，调控IL-1β在细胞内的转录和表达。这与Lee等[13]关于柿子多糖免疫调节信号通路、Li等[14]关于光滑环锈伞多糖对骨髓源树突状细胞的免疫调节通路、Sun等[15]对猕猴桃多糖对巨噬细胞免疫调节的信号通路等的研究结果相一致。

本试验同时发现，TLR4抗体可以完全阻断IL-10、iNOS和TNF-αmRNA的表达，而且PDTC对阻断淋巴细胞IL-10、iNOS和TNF-αmRNA表达的作用也十分显著，由于IL-10主要由Th2细胞和单核巨噬细胞产生，而TLR4只能表达在B细胞或巨噬细胞等髓样细胞上，而Th2细胞并不表达，因此可以推断体外培养24 h的淋巴细胞在ASPS作用下所表达的IL-10 mRNA应该都是巨噬细胞产生，而Th2细胞要产生IL-10时间应该再滞后。本试验还发现，TLR2抗体也能够部分阻断iNOS和TNF-αmRNA 的表达，iNOS和TNF-α是巨噬细胞分泌的重要细胞因子，因此可以证明ASPS可以与巨噬细胞上的TLR2和TLR4受体结合，但更倾向与TLR4受体结合，从而促进其表达IL-10、iNOS和TNF-αmRNA，其可能的信号通路为主要为TLR4→TRAF6→IKKc→ NF-κB，TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB也有一定作用，另外这与韩杰等[16]关于刺五加多糖对断奶仔猪外周血淋巴细胞信号传导影响的研究结果一致。

TLR4抗体可以部分阻断ASPS促进IL-2和IFN-γmRNA的表达，而TLR2抗体和PDTC对IL-2和IFN-γmRNA的表达均没有影响。由于IL-2和IFN-γ主要由Th1类细胞产生，而且Th1类细胞可以在巨噬细胞产生的细胞因子如IL-1β等的刺激下增殖分化，产生更多的IL-2和IFN-γ，而且TLR4主要存在于巨噬细胞或B细胞，因此IL-2和IFN-γmRNA的表达应该与TLR4→TRAF6→IKKc→NF-κB 信号通路无关，对于TLR4抗体可以部分阻断ASPS促进IL-2和IFN-γmRNA的表达，可能原因是：TLR4抗体使IL-1β等巨噬细胞分泌因子减少，因而Th1类细胞缺少了一部分刺激，从而导致IL-2和IFN-γmRNA下降。但是对于ASPS促进IL-2和IFN-γmRNA的表达具体与什么通路直接相关还有待于以后继续研究。

细胞内信号转导通路错综复杂，多糖在进行免疫调节时涉及多条通路，而且各通路之间可能存在相互作用，另外多糖的结构复杂，多糖分子的结合受体较多，要完全阐明多糖的免疫调节机制依然是任重而道远，本试验结合ASPS对鸡的各种免疫调节作用，通过对TLR2/4→TRAF6→ IKKc→NF-κB通路的追踪，初步对免疫机制进行探索性的研究，以后还要对ASPS对免疫调节机制更进一步研究。