口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病疫苗联合免疫临床效果评估

刘国民 ， 高日明 ， 林文耀 ， 宋庆庆 ， 尚 策 ， 王 凯

(金宇保灵生物药品有限公司 , 内蒙古 呼和浩特 010030)

在非洲猪瘟背景下部分养猪场采取静默生产、少打疫苗、不打疫苗或减少猪只接触等方式防控非洲猪瘟，通过临床实践证明，规模化猪场主要通过生物安全、物理隔断或改变常规免疫程序等方式来防控非洲猪瘟，但不打常规疫苗是一种不科学的做法，常规疾病防控也是生物安全的工作内容之一。为有效减少接触，降低疫苗免疫次数，孟丽军等做了大量活疫苗与灭活疫苗联合免疫方案的研究，疫苗操作时大部分用的是疫苗分点注射[2]。而本试验探讨口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)、猪瘟(Classical swine fever，CSF)、伪狂犬病(Pseudorabies,PR)3种常规疫苗联合使用的可行性，目的是提高基层免疫工作质量，降低劳动强度，减少工作量，提高口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病免疫密度和免疫效果，降低猪群疫病发生的风险，从而为制定联合免疫程序提供参考[1]。

1 材料与方法

1.1 疫苗 口蹄疫灭活疫苗由金宇保灵生物药品有限公司提供(商品名：金OA)，批号：18392243；猪瘟ST传代细胞苗由辽宁益康提供(商品名：瘟康)，批号：201841；伪狂犬病耐热保护剂C株苗由扬州优邦生物药品有限公司提供(商品名：伪狂宁)，批号：18251003，上述疫苗均按说明书的要求进行保存、运输。

1.2 试剂 口蹄疫O/A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号：2019122401；猪瘟ELISA抗体检测试剂盒，IDEXX公司产品，批号：433220-P361；猪伪狂犬病gB抗体ELISA试剂盒(ADV-gB)，由荷兰BioChek百测公司提供，批号：2331106；其他常规仪器均由国家兽用工程实验室提供。

1.3 试验动物 选取广西玉林某规模猪场的后备母猪1 000头、 陆川某规模猪场的经产母猪1 000头、 桂林区域的保育猪2 500头进行此次试验，采取人工投料，猪只自由采食，自由饮水，试验周期为2019年6月1日—2020年2月1日。

1.4 试验方案

1.4.1 疫苗理化性检验和疫苗活性的评估 在实验室条件下用口蹄疫灭活疫苗稀释猪瘟、伪狂犬疫苗，检测稀释后疫苗的理化性、活性是否受影响。主要检测口蹄疫灭活疫苗的pH、半数组织培养感染剂量(TCID50)、黏度、粒度和稳定性，并通过荧光定量PCR检测混合后的猪瘟疫苗、伪狂犬疫苗的活性，分析组合免疫方案的可行性。具体操作：取2瓶猪瘟冻干苗，其中1瓶用20 mL口蹄疫灭活苗复溶，复溶后于室温作用0、1 h和2 h，分别用MEM溶液作10倍系列稀释进行TCID50检测；另1瓶猪瘟疫苗做常规疫苗稀释；取3瓶伪狂犬病冻干苗，用10 mL口蹄疫灭活苗进行复溶，复溶后于室温作用0、1 h和2 h后，分别用MEM溶液进行10倍系列稀释进行TCID50检测。

1.4.2 疫苗在猪场安全性和有效性的评估 为验证组合免疫在猪场的安全性和有效性，将后备猪、经产母猪、保育猪分别分成5个组，即A、B、C、D组和E组，均于40日龄时免疫对应的疫苗，70日龄时进行二免，通过测定口蹄疫、猪瘟、伪狂犬抗体水平，分析各组别之间的差异，最终确定组合免疫在临床上的可行性。A、B、C组为单因素对照组，其中A组猪只仅免疫猪瘟疫苗(CSF)，用猪瘟稀释液稀释；B组猪只仅免疫伪狂犬疫苗(PR)，用伪狂犬稀释液稀释；C组猪只仅免疫口蹄疫灭活疫苗(FMD)；D组和E组为联合免疫组，其中D组猪只免疫猪瘟和伪狂犬疫苗组合疫苗(CSF+PR)，用伪狂犬或猪瘟稀释液稀释；E组猪只免疫口蹄疫、猪瘟、伪狂犬联合混合疫苗(FMD+CSF+PR)，用口蹄疫稀释液稀释。上述组别均需要在免疫前采血评估猪群抗体水平及健康程度；分别在一免后30 d、二免后30 d采血评估免疫效果，免疫注射时给所有猪只佩戴耳标、做好记录。试验动物分组与免疫方案见表1。

表1 试验动物分组与免疫方案Table 1 Grouping and immunization plan of test animals

1.4.3 统计分析 用SPSS Statistics 20.0软件进行单因素方差分析，P>0.05表示差异不显著，P<0.05 表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 实验室评估物理性质与疫苗活性 结果见表2、表3。用口蹄疫灭活苗复溶猪瘟、伪狂犬病冻干苗时，猪瘟冻干苗溶解较慢，在2～3 min后能够全部溶解，而伪狂犬病疫苗在1～2 min全部溶解；疫苗溶解后pH介于7.23～7.60；混合后的疫苗黏度介于25.29～43.45CP；混合后的疫苗通过粒度检测都是标准单峰，离心没有水乳分层，猪瘟、伪狂犬病疫苗通过实时荧光定量PCR检测病毒含量无显著差异(P>0.05)，说明使用口蹄疫灭活疫苗可以有效稀释猪瘟、伪狂犬病疫苗，而且猪瘟、伪狂犬病疫苗活性不受影响。

表2 试验组与对照组疫苗理化性检验分析Table 2 Analysis of physical and chemical tests of vaccines between the test group and the control group (n=4)

表3 试验组与对照组疫苗猪瘟、伪狂犬活性分析Table 3 Analysis of the viability of vaccines against swine fever and pseudorabies in the test group and the control group (n=4)

2.2 临床评估联合免疫效果

2.2.1 免疫应激反应观察 联合免疫推广区域猪只免疫后24 h内个别区域有零星轻微应激，通过物理抢救和临床处理均未出现死亡，推广区域的大部分猪只均未出现精神沉郁、饮食减退和死亡等异常免疫反应情况，见表4。

表4 试验猪免疫副反应情况Table 4 Immune side effects of test pigs n=39

2.2.2 口蹄疫抗体指标效果分析 结果见表5和图1，通过口蹄疫抗体水平试验数据分析可知，猪群单独免疫口蹄疫疫苗2次，抗体水平与疫苗混合组(口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病)抗体水平差异不明显(P>0.05)，说明单独免疫效果与组合免疫效果相当，即组合免疫组(口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病)注入猪体后不影响口蹄疫免疫效果；通过一免后30 d和二免后30 d抗体数据分析可知，组合免疫组与单独免疫口蹄疫组的免疫持续期差异不显著(P>0.05)，特别是组合免疫组二免后30 d效果几乎不受影响。

图1 口蹄疫抗体指标比较Fig.1 Comparison of antibody indexes in foot-and-mouth disease

2.2.3 猪瘟抗体指标效果分析 结果见表5和图2，通过猪瘟抗体分析可知，免疫前抗体水平与一免后30 d、二免后30 d差异不显著，组间比较，各组之间差异不显著(P>0.05)，说明组合免疫组不影响猪瘟免疫效果。

图2 猪瘟抗体指体比较Fig.2 Comparison of antibody indexes in swine fever

2.2.4 伪狂犬病抗体指标效果分析 结果见表5和图3，通过伪狂犬病抗体分析可知，组合免疫组一免后30 d、二免后30 d与免疫前的gB抗体水平差异显著(P<0.05)，说明免疫疫苗后伪狂犬病抗体快速提升，保护力提高。但从组间分析可知，联合免疫组抗体水平高于单苗免疫组，组合免疫组不影响伪狂犬疫苗的免疫效果。

图3 伪狂犬gB抗体指标比较Fig.3 Comparison of gB antibody indexes in pseudorabies

表5 口蹄疫、猪瘟、伪狂犬疫苗组合免疫抗体持续期跟踪分析Table 5 Tracking analysis of the duration of immune antibody in FMD,SFV,and PR combinational vaccine (n=15)

3 讨论

国内科研人员在猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征疫苗同步免疫研究方面进行了较多的试验探索[3-4],并取得了一些成功经验。有研究指出，猪口蹄疫疫苗与猪瘟脾淋活疫苗可同时进行免疫,而猪口蹄疫不能与高致病性猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗进行同时免疫,3种疫苗不能同时免疫,存在相互干扰现象[5]。陆国林等[6]提出，猪瘟、猪口蹄疫和高致病性猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗可同时分点免疫。相关研究还有很多，结论有所不同，原因有待科研人员进一步研究。

3.1 非瘟时代下，降低人猪接触的重要性 在非洲猪瘟肆虐的背景下，做好口蹄疫、伪狂犬病和猪瘟的免疫防控可以有效提高猪群的健康，提高易感动物的抵抗力，筑起抵抗非洲猪瘟的防线。有研究表明，相同感染剂量下，液体组和饲料组随着暴露次数增加，非洲猪瘟的感染概率也随之增加。当液体组的暴露次数达到10次时，最低感染剂量1 TCID50的感染概率接近1。由此可见，减少免疫次数的同时减少人猪接触的次数，降低针头传播疾病的风险，可大大降低非洲猪瘟感染的概率，多联多价、组合免疫是未来猪场免疫程序变化的必然趋势。

3.2 降低人猪接触、减少应激，构建“一针多防”的组合免疫方案的可行性 猪产生应激反应究其原因可分为内部原因和外部原因，内部原因主要是由于猪自身的身体状况、品种以及个体之间的差异性所导致的；而外部原因主要与疫苗的储存、纯化工艺有关；应用高纯度、高纯化的疫苗，可以减少因疫苗因素造成的猪只应激，减少疫苗中的杂蛋白、细胞碎片、内毒素，可降低猪只应激率；猪只免疫前添加一些抗应激药如中草药、维生素、矿物质、电解质，可以增强猪只的适应性，从而缓解猪只的应激反应。建议猪场在接种完疫苗后，对猪只进行3～5 min观察，如果出现应激，通过扎鼻子、揉肚子、泼凉水等物理方式进行抢救；严重应激可肌内注射肾上腺素或地塞米松进行抢救。非洲猪瘟常态化如何减少猪群的应激，重构猪群的免疫程序，鉴于此，结合本公司丰富可靠的产品，提出了“一针三防”的理念，并在此基础上进行了大量的实验室验证及临床应用研究，结果发现，基于本公司产品线建立的“一针三防”效果非常理想。70日龄时免疫口蹄疫(口蹄疫首免)，猪瘟(猪瘟二免)，伪狂宁(首次肌内注射)。同时设单个疫苗对照组，免疫前、免疫后30 d对比抗体的变化，评估方案的可行性。具体操作，口蹄疫疫苗作为稀释液稀释伪狂犬病毒疫苗，然后再稀释猪瘟病毒疫苗，后进行免疫。通过方法创新形成口蹄疫-伪狂犬病-猪瘟三联苗，进行1次注射免疫即可。

3.3 “一针三防”组合免疫 林文耀等[7]通过口蹄疫抗体水平分析发现，单独免疫效果与联合免疫效果相当，即联合免疫组(口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病)注入猪体后不影响口蹄疫免疫效果，特别是联合免疫组二免后30 d口蹄疫效果几乎不受影响。猪瘟抗体水平分析，免疫前抗体水平与一免后30 d、二免后30 d差异不显著；各组之间比较差异不显著，说明联合免疫不影响猪瘟免疫效果。伪狂犬病抗体分析，联合免疫组一免后30 d、二免后30 d的效果与免疫前差异显著(P<0.05)，说明免疫后伪狂犬病抗体快速提升，保护力提高。

综上所述，3种疫苗同时免疫后，猪瘟和伪狂犬有免疫协同的作用，口蹄疫抗体无显著差异，说明“一针三防”是可行的。联苗共同刺激动物的免疫器官后有提高免疫应答的作用，口蹄疫疫苗的油佐剂兼具抗原缓慢释放的同时有免疫增强的作用。但必须意识到，不同厂家生产的疫苗因其生产工艺、佐剂类型不同，组合免疫效果差异极大。本试验是基于本公司产品的基础上进行的组合免疫应用方案，该方案的结论不适用于其他厂家的疫苗产品与本公司产品进行组合免疫，同样也不适用于其他厂家生产的产品进行组合免疫。“一针三防”的好处是口蹄疫+猪瘟+伪狂犬病同时免疫而不影响各自的免疫应答，可以有效减少免疫次数，减少人和猪的接触频率，减少人工劳力，有效降低猪只的应激，提高猪群抵抗力，70 日龄肌内注射免疫，随着母源抗体的衰退，可以有效减少母源抗体的干扰。本试验结果可为广大养殖户提供优化免疫程序的参考依据。