奶牛布鲁氏菌病6种血清学检测方法对比试验

马贵达 ， 张若曦 ， 顾文源 ， 马宏伟 ， 刘天驹 ， 孙泰然 ， 李春国 ， 程丽华 ， 边青岩 ， 石兴亚 ， 路广计

(1.河北省动物疫病预防控制中心 ， 河北 石家庄 050035 ； 2.河北省保定市动物疫病预防控制中心 ， 河北 保定 071027 ； 3.河北省唐山市玉田县动物疫病预防控制中心 ， 河北 玉田 064100 ；4.河北省衡水市饶阳县农业农村局 ， 河北 饶阳 053900)

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病，在世界各地牛、羊养殖地区均有发生，其发病主要特征为怀孕母畜流产、不孕、乳腺炎 ； 公畜睾丸炎、不育等[1]。人感染布病后，其主要临床症状为发热(波状热、低热)、乏力、大汗、关节炎等，严重的病人可导致骨关节损伤等其他功能障碍[2-3]。目前，在我国布病最为流行的动物是牛和羊，主要传染源是带菌和患病动物，尤其是患病妊娠母畜在流产或分娩时排出的羊水、胎衣和胎儿，携带了大量布鲁氏菌，成为传播本病的最大隐患[4]。布病在我国已经流行多年，经长期防治虽得到有效控制，但近年来由于集约化奶牛养殖规模骤增，发病率呈现逐年上升趋势，尤其是在我国畜牧业较为发达的北方地区，人间布病的发生与动物布病的发生呈现正相关性，因此，科学防控布鲁氏菌病对人民群众食用放心乳制品、肉制品及畜牧业的健康发展有着重要意义[5-6]。

目前，我国有效防控和净化布鲁氏菌病的主要措施是疫苗免疫和血清学诊断，然而疫苗免疫抗体对血清学诊断存在一定干扰影响，无法准确判定检测结果[7-8]。目前，我国奶牛普遍使用A19株疫苗和S2疫苗，前者来源于牛种布鲁氏菌，后者来源于猪种布鲁氏菌。因此，本试验结合临床上常用的A19和S2布鲁氏菌疫苗，通过免疫试验牛，利用虎红平板凝集试验(Rose bengal plate test,RBT)、间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)、乳汁间接酶联免疫吸附试验(Milk indirect enzyme-linked immunosorbent assay,mELISA)、琼脂扩散试验(Agar diffusion test,AGID)和布病检测试纸卡6种方法进行检测，综合对比6种检测方法对A19疫苗免疫群(注射)和S2疫苗免疫群(口服)的阳性检出率，以期摸索出适用于规模化奶牛场布鲁氏菌病净化的检测方法，为奶牛布鲁氏菌病的准确诊断和科学防控提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 在选定规模化奶牛养殖场，采用RBT、iELISA和cELISA三种方法对牛群平行检测，其检测结果均为阴性的作为假定布病阴性(健康)试验牛，结果均为阳性的作为假定布病阳性(感染)试验牛；共筛选出40头奶牛作为试验用牛，其中20头 布病阴性后备奶牛、10头布病阴性泌乳奶牛和10头布病阳性泌乳牛，记录耳标编号进行分组。

1.2 主要试剂 布鲁氏菌疫苗：A19疫苗(18941002)、S2疫苗(18939003)，均购自金宇保灵生物药品有限公司；虎红平板凝集试验抗原(20170810)，购自中国兽医药品监察所；布鲁氏菌间接ELISA试剂盒(110917)、布鲁氏菌乳汁检测间接ELISA试剂盒(100717)、布鲁氏菌竞争ELISA试剂盒(050318)、琼脂扩散试验抗体检测试剂盒(020218)，均购自INGEZIM公司；布病检测试纸卡(G180418311)，购自上海快灵生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 酶标仪(安图实验仪器郑州有限公司，型号PHOMO)；隔水恒温箱(上海智城分析仪器制造有限公司，型号ZXGP-A2270)；微量移液器(德国Eppendorf公司)。

1.4 免疫试验 将20头布病阴性后备牛分为2个组， 每组10头，分别为A19注射免疫组和S2口服免疫组；10头布病阴性泌乳牛和10头布病阳性泌乳牛均口服S2疫苗进行免疫，按照分组免疫(表1)将试验牛分栏饲养，记录并观察牛群状态。

表1 免疫试验分组Table 1 Immunological experiment group

1.5 样品采集 在首次免疫当天及免疫后15、30、60、90、120、150、180、210 d和240 d，对选定后备奶牛、泌乳牛颈静脉采集5 mL血液样品，分离血清；对试验泌乳牛采集5 mL牛奶样品，-20 ℃冷冻保存，以备检测。

1.6 检测方法 RBT方法，按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646—2018)进行操作与结果判定；iELISA、mELISA、cELISA、AGID和布病检测试纸卡，均按照试剂盒所提供说明书进行操作与结果判定，对检测结果进行统计分析。

2 结果

2.1 后备牛A19疫苗免疫抗体阳性率对比分析 经注射免疫A19疫苗的后备牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、AGID和布病检测试纸卡5种方法对不同时间点采集的样品进行检测，结果显示(图1)，5种检测方法在免疫后90 d内均可检出阳性，阳性检出率由高到低依次为布病检测试纸卡、iELISA、RBT、AGID-LPS(阳性为免疫抗体)，其中RBT、iELISA、cELISA方法在免疫后15～30 d阳性率为100%，随后呈下降趋势；但cELISA阳性率在免疫后150 d呈升高趋势，与其他检测方法阳性检出率趋势相反。

图1 后备牛A19疫苗免疫后不同检测方法检出率对比Fig.1 Comparison of detection rates of different detection methods in reserve cattle after immunized with A19 vaccine

2.2 后备牛S2疫苗免疫抗体阳性率对比分析 经口服免疫S2疫苗的后备牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、AGID和布病检测试纸卡5种方法对不同时间点采集的样品进行检测，结果显示(图2)，由于S2疫苗免疫诱导所产生抗体水平较低，RBT、AGID均无阳性检出；iELISA、cELISA和检测试纸卡均可检出阳性，其中免疫后30 d iELISA方法检出率最高达90%，后备奶牛S2疫苗免疫抗体检测灵敏度显著高于检测试纸卡；而cELISA方法在免疫180 d后有阳性检出。

图2 后备牛S2疫苗免疫后不同检测方法检出率对比Fig.2 Comparison of detection rates of different detection methods in reserve cattle after immunized with S2 vaccine

2.3 阴性泌乳牛S2疫苗免疫抗体阳性率对比分析 经口服免疫S2疫苗的布病阴性泌乳牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、mELISA、AGID和布病检测试纸卡6种方法对不同时间点采集的样品进行检测，结果显示(图3)，由于S2疫苗免疫诱导产生的抗体水平较低，RBT、AGID均无阳性检出；iELISA、cELISA和mELISA三种检测方法均可检出阳性，其中iELISA和mELISA在180 d内有阳性检出，且检出率最高达80%，然而在60 d内iELISA检出率高于mELISA，60 d后检出率趋势相反；布病检测试纸卡在30 d内阳性检出率最高，可达到83.3%，随后检出率下降，120 d无法检出；此外，在免疫60 d后cELISA有阳性检测，且阳性检出率逐渐升高。

图3 阴性泌乳牛S2疫苗免疫后不同检测方法检出率对比Fig.3 Comparison of detection rates of different detection methods in negative lactating cattle after immunized with S2 vaccine

2.4 阳性泌乳牛S2疫苗免疫抗体阳性率对比分析 经口服免疫S2疫苗的阳性泌乳牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、mELISA和AGID五种方法对不同时间点采集的样品进行检测，结果显示(图4)，5种方法均可检出阳性，在免疫60 d内，检出率均为100%；综合对比分析，iELISA检测敏感度最高，RBT和mELISA检测阳性率均在90%，免疫180 d 后检出率开始降低，AGID-NH(阳性为感染抗体)在免疫120 d后检出率开始降低；而cELISA检出阳性率在免疫180 d后呈上升趋势。

图4 阳性泌乳牛S2疫苗免疫后不同检测方法检出率对比Fig.4 Comparison of detection rates of different detection methods in positive lactating cattle after immunized with S2 vaccine

2.5 布病检测试纸卡符合率检测 为了验证布病检测卡的特异性和敏感性，对已知的20份布病阴性和10份阳性血清进行定性检测，结果显示(表2)，布病检测试纸卡阳性符合率(敏感性)100.00%，阴性符合率(特异性)90.00%，总符合率为93.33%。

表2 布病检测试纸卡符合率检测Table 2 Detection of conformity rate of Brucellosis test paper card

3 讨论

布鲁氏菌病的发生与传播，不仅对奶牛养殖业造成巨大危害，还对人类健康公共卫生带来严重威胁，因此早期诊断是有效控制本病的主要措施。在临床上，由于受实验室条件的限制，难以开展布鲁氏菌的分离鉴定工作，因此，血清抗体检测作为一种操作简便，具有敏感性高和特异性强的特点而被广泛应用[9-10]。

目前，诊断动物布鲁氏菌病的血清学方法较多，主要有RBT、试管凝集试验(Serum tube agglutination test,SAT)、补体结合试验(Completement fixation test,CFT)以及ELISA检测法等[11]。现行国标中SAT是确诊布病的定性方法，但由于检测程序繁琐，敏感性和特异性较低等原因，在世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)参考中已不再使用。CFT是OIE指定的国际贸易中布病的诊断方法，虽然其特异性强，但由于操作复杂，对检测者要求高，往往会出现漏检现象，对养殖场布鲁氏菌病的净化并不适用[12-13]。

本试验选用RBT、iELISA、cELISA、mELISA、AGID和布病检测试纸卡6种检测方法,对不同免疫群体进行抗体检测并比较分析。研究结果发现，不同疫苗免疫群体中iELISA检测方法均具有较高的敏感性和检出率；布病检测试纸卡对后备牛A19免疫抗体检测最为敏感，在后备牛S2免疫后也有较高检出率，但并未达到100%，免疫90 d后无法检出；然而iELISA和布病检测试纸卡对S2免疫抗体检出率在各时期均未达到100%，并且在免疫60 d后阳性检出率开始下降，RBT在后备牛A19免疫后和布病阳性泌乳牛S2免疫后有一定检出率，但后备牛和阴性泌乳牛在S2疫苗免疫后，均无法检出，其原因可能是A19疫苗株的毒力大于S2疫苗株，从而S2免疫群产生抗体的水平低于A19免疫群，A19疫苗肌内注射的免疫效果优于S2疫苗口服免疫，A19比S2诱导机体产生的免疫抗体水平更高、持续时间更长，综合分析可能与S2疫苗免疫产生的抗体水平与消长规律具有相关性。mELISA在泌乳牛群中均有阳性检出；AGID-LPS和AGID-NH在阳性泌乳牛群中有检出，并能够准确鉴别感染抗体与免疫抗体，而AGID-LPS仅在后备牛免疫A19疫苗中有检出；此外，cELISA检测方法普遍在免疫后期有阳性检出。

本试验6种检测方法中，仅AGID能有效鉴别感染抗体和免疫抗体，在免疫60 d后检出率降低，可能是因为感染牛在疫苗免疫后开始转阴所致。目前，AGID作为引进的一种区分布鲁氏菌自然感染抗体和疫苗免疫抗体的方法。AGID-LPS抗体与AGID-NH抗体均有检出则为感染牛群，在阳性泌乳牛接种S2疫苗试验中得到验证；AGID-LPS抗体阳性、AGID-NH抗体阴性的为免疫牛，在阴性后备牛接种A19疫苗试验中得到验证；AGID-LPS抗体、AGID-NH抗体均为阴性的牛为未免疫或低免疫抗体的健康牛，在阴性后备牛免疫A19或S2疫苗、阴性泌乳免疫S2疫苗试验中得到验证。因此，AGID方法可适用于布鲁氏菌免疫背景不清或尚未超过免疫干扰期的牛群血清检测。

4 结论

不同检测方法对不同生长阶段和免疫背景的奶牛抗体检测能力存在差异。iELISA敏感性最高，其次为布病检测试纸卡，二者均可适用于自然感染牛群的初筛及A19和S2疫苗免疫效果的评价；此外，RBT也具有较高的敏感性，适用于自然感染牛的初筛及A19疫苗免疫效果的血清抗体评价，但并不适于S2免疫效果评价；在临床布病初筛中，布病检测试纸卡可替代RBT进行检测；mELISA适用于泌乳牛自然感染的初筛、免疫效果评价的乳清抗体检测；cELISA是国际公认的除CFT以外特异性最高的方法，适用于感染晚期确诊，与iELISA二者相结合，则可适用于规模化奶牛养殖场的布鲁氏菌病净化；AGID适用于免疫背景不清或尚未超过免疫干扰期的牛群检测，可有效区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体，适用于布病的确诊和规模化奶牛场的引种、净化工作。