联合应用线粒体SNP和线粒体DNA高变区测序排除同一母系鉴定1例

钱雪松

上海东南鉴定科学研究所，上海 200051

1 案 例

1.1 简要案情

因申报户口需要，养父母携养女来本所，要求对养父母与养女之间是否存在亲生血缘关系进行鉴定。鉴于养父母各有一个姐姐，还要求对养父母与养女是否来源于同一母系进行鉴定。

1.2 常染色体STR检验

提取养父母与养女的血样DNA，应用MicroreaderTM21（Direct）ID System（北京阅微基因技术股份有限公司）进行PCR 复合扩增，扩增产物经3500xL 基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）电泳分离和激光扫描分析，用GeneMapperTMID-X软件（美国Applied Biosystems 公司）分析，得到3 份血样的分型结果。结果表明，养女在D19S433、D18S51、D6S1043等多个基因座的等位基因不能从养父母的基因型中找到来源，父女、母女的累积亲权指数均小于1/10 000。

1.3 线粒体SNP检验

取适量上述血样DNA，应用Expressmarker mtDNASNP60荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）进行PCR 复合扩增，扩增产物经3500xL 基因分析仪电泳分离和激光扫描分析，用GeneMapperTMIDX软件分析，得到上述检材的分型结果。结果（表1）表明，养父与养女在检测的60 个SNP 位点上有14 个SNP 位点分型结果不同，可以排除养父的姐姐为养女的生物学母亲。养母与养女在检测的60 个SNP 位点上分型结果均相同，无法排除养母的姐姐为养女的生物学母亲。

表1 线粒体SNP的检验结果Tab.1 Test results of mitochondrial SNP

1.4 线粒体DNA高变区序列检验

取适量上述血样DNA，用引物L16047/H16464和L29/H408 对线粒体DNA 高变区Ⅰ和高变区Ⅱ进行PCR 扩增，扩增产物经3500xL 基因分析仪电泳分离和激光扫描分析，并与Anderson 标准序列进行比对，得到上述血样的线粒体DNA 序列特征。结果（表2）表明，养父与养女、养母与养女在线粒体DNA 高变区Ⅰ和高变区Ⅱ的序列特征不一致，在排除养父的姐姐为养女生物学母亲的基础上进一步排除了养母的姐姐为养女的生物学母亲。

表2 线粒体DNA高变区的测序结果Tab.2 Sequencing results of mitochondrial DNA hypervariable region

1.5 鉴定意见

依据现有资料和常染色体STR 检验结果，排除养父是养女的生物学父亲，排除养母是养女的生物学母亲。

依据现有资料和线粒体DNA 检验结果，排除养父、养母与养女来源于同一母系。

2 讨论

人类线粒体DNA 被认为是严格遵照母系遗传的。受精过程中只有精子核进入卵细胞，直接与卵细胞核结合，精子并不提供其他的细胞成分。当受精卵细胞分裂、胚囊发育时，除细胞核外，细胞质和其他细胞组分与母亲的卵细胞是一致的。因此，母体中线粒体DNA 分子直接传给所有子代且不受任何男性因素影响。在没有突变的情况下，母亲将其线粒体DNA传给子女，兄弟姐妹就与母系亲属拥有了相同的线粒体DNA序列，由此可知，每个个体的线粒体DNA分型并不是独一无二的[1]。线粒体DNA 分析的缺点之一就是在各人群都存在一些很常见的单倍体。例如在美国联邦调查局（Federal Bureau of Investigation，FBI）的线粒体DNA 数据库所包含的1 655 个高加索人样本中，有131 名个体都表现为“263G、315.1C”这种常见型，另外还有264 名个体与这种常见型仅存在1 个碱基的差异。也就是说，如果一个未知样本表现为这种常见单倍体，那么数据库中1 655 个高加索人中的395个（23.9%）都不能被排除[1]。

线粒体DNA 的大小约16 569 bp[1]，不同厂家的试剂盒选择的检测技术和位点有所不同，由于线粒体的遗传特性，存在无关个体线粒体分型一致的情况，即便是变异率较高的线粒体DNA 控制区内也只有1%～2%的变异（不相同）[1]，因此，线粒体DNA 检测结果不能用于同一个体或同一母系认定，而是通过进一步补充检测作为能否排除的依据。

本例中，养母与养女的常染色体STR 分型结果显示无亲生血缘关系，但在Expressmarker mtDNASNP60 荧光检测试剂盒的60 个SNP 位点上分型结果均一致。据此，在不能排除同一母系的情况下，领养报户程序难以进行，经与委托人反复核实其领养情况属实后考虑增加位点进一步确认。因线粒体DNA 控制区的变异率高，且均散布在高变区Ⅰ和高变区Ⅱ，所以使用引物针对该两区进行双向测序分析，结果显示养母及养女存在5个序列（16183、16193.1、195、204、309.1）特征不一致，排除来源于同一母系。

综上，在领养案的同一母系认定（排除）鉴定中，Expressmarker mtDNA-SNP60 荧光检测试剂盒的应用往往因其操作便利而被广泛使用[2]，但其所涉及位点未在高变区Ⅰ和高变区Ⅱ达到全覆盖（60 个SNP位点有8 个位于高变区）。一般情况下，使用试剂盒检出结果完全一致的无关个体并不多见，但本例检测结果提示，使用试剂盒检测可能存在位点不足的风险。因此，在试剂盒检测结果与案情相矛盾时，应该考虑进行线粒体测序进行确认。