青海高山辣根菜中水溶性总多糖的提取工艺研究

王 欢， 刘明珠， 芦永昌*

(1.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；3.青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007；4.青海省现代藏药创制工程技术研究中心，青海 西宁 810007)

高山辣根菜(Pegaeophytonscapiflorum)为十字花科植物无茎荠的干燥根和根茎[1-3]。根茎顶端有数个分枝，有密集横环纹，其上有叶柄残基。根圆柱形，长5-16cm，直径0.6-1.5cm。表面黄棕色至灰黄褐色，粗糙，有明显的皱纹和纵沟。质松泡，易折断，断面不整齐，皮部淡棕色至黄棕色，木部淡黄白色至浅黄棕色，周边与中心部呈灰白与黄色相间的花纹。《藏医卷》记载其主要用于肺热及肺病引起的咳嗽、咯血、肺水肿、气管炎和发热等的治疗。藏医经典著作中对其功效的记载为清热滋阴和凉血止血[4-5]。本试验研究高山辣根菜中多糖的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、药材

ST-08B型高速万能粉碎机(永康市帅通工具有限公司)；台式高速冷冻离心机(赛墨飞世尔科技有限公司)；UV-Vis 1240型紫外—可见分光光度计(岛津(香港)有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂)；电子天平(梅特勒—托力多仪器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

葡萄糖、苯酚、95%乙醇、浓硫酸、0.3mol/L HCl、0.3mol/L NaOH均为分析纯。

2020年7月，高山辣根菜采于青海省，经青海民族大学芦永昌教授鉴定为高山辣根菜。

1.2 试验方法

1.2.1对照品贮备液的制备

精密称取105℃烘干至恒重的葡萄糖对照品1.0g葡萄糖，用适量蒸馏水溶解再用水定容到100ml容量瓶中，摇匀。再从中吸取1ml移入25ml容量瓶，用水定容，摇匀，即得0.4mg/ml的对照品贮备液。

1.2.2 苯酚溶液的制备

称取苯酚25.0g，用适量蒸馏水溶解，最后定容于500ml棕色容量瓶中，摇匀，即得质量分数为5%的苯酚溶液，置冰箱中冷藏备用。

1.2.3 标准曲线的制备

精密量取标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于10ml容量瓶中，再依次加入1.0(空白对照)、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml蒸馏水使成1.0ml，加入新制的5%苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速沿壁加入浓硫酸5ml，摇匀，室温冷却后，加水定容至刻度。将以上样品于30℃水浴中加热显色15min，室温冷却，于紫外—可见分光光度计上490nm波长处测其相对应的吸光度，记录数据。以吸光度A对其相对应的葡萄糖浓度C进行线性关系拟合，获得标准曲线，如图1所示。研究结果表明，线性关系良好，相关方程为A=0.0191C+0.0291，r=0.9995。

1.2.4 最大吸收波长的选择

取对照品溶液1ml于10ml容量瓶中，以1ml蒸馏水同法显色做空白，按照1.2.3项下的操作方法显色，在350-700nm间进行紫外光谱扫描(扫描间距2nm)。另取样品溶液1ml同法显色重复试验，结果发现二者均在490nm处有最大吸收峰，因此确定最大检测波长为490nm[6-8]。

1.2.5 正交试验设计

在单因素试验的基础和相关文献的参考下[9-11]，对提取过程采取正交试验设计。以高山辣根菜多糖提取液中多糖提取率为考察指标，对工艺中的固液比、提取温度、提取时间、提取次数进行考察，因素及水平设计见表。

表1 正交实验因素水平Table.1 Orthogonal experimental factors

2 结果与分析

2.1 提取次数对多糖得率的影响

在温度为85℃中回流提取，固定料液比(液为水)1∶20，提取时间2h，分别对2.0g高山辣根菜粉末提取1、2、3、4、5次，过滤且将滤液定容于50ml容量瓶中。再从上述溶液中取1ml定溶于25ml容量瓶。继续从以上稀释的样品中取1.0ml，加以上显色剂于10ml容量瓶中显色，定容后测其相对应的吸光度，总多糖提取率的结果如图2所示。实验结果表明，提取3、4、5次的提取率和提取2次时的提取率相差不大，考虑节省时间，最优提取次数选为提取2次。

2.2 固液比对多糖得率的影响

温度为85℃中回流提取，固定提取次数2次，提取时间2h，分别对2.0g药材加入1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的水进行提取，过滤并将滤液定容于50ml容量瓶中。以上容量瓶中取1ml定溶于25ml容量瓶，再继续从以上稀释后样品中取1.0ml加入以上显色剂于10ml容量瓶中显色定容后测吸光度，多糖的提取率如图3所示。由试验结果可知，料液比在1∶20后提取率增加不明显，考虑节省资源，最佳料液比选为1∶20。

2.3 提取时间对总多糖提取率的影响

温度为85℃中回流提取，固定料液比1∶20，提取次数2次，分别对2.0g药材进行1、1.5、2、2.5、3h提取，过滤且将滤液定容于50ml容量瓶中。从上述溶液中移取1ml定溶于25ml容量瓶，再继续从以上稀释液中移取1.0ml，加入显色剂于10ml容量瓶中显色定容后测其相对应的吸光度，结果如图4所示。由试验结果可知，提取时间为2h后，多糖的提取率增加不明显，因此，该试验最佳提取时间选为2h。

2.4 提取温度对多糖得率的影响

固定料液比1∶20，提取次数2次，提取时间为2h，分别对2.0g药材在65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃进行提取，过滤且将滤液定容于50ml容量瓶中。从以上溶液中移取1ml定溶于25ml容量瓶，再从以上稀释溶液中取1.0ml，加显色剂于10ml容量瓶中显色定容后测其相对应的吸光度，实验结果如图5所示。由研究结果可知，总多糖提取率在温度为85℃后提取率变化不大，因此，最佳的提取温度为85℃。

表2 正交试验结果Table.2 Orthogonal test results

表3 总多糖方差分析表Table.3 Analysis of variance of total polysaccharides

从表2可以看出，提取高山辣根菜中多糖时，料液比、提取时间、水浴温度和提取次数四因素对多糖提取率影响的主次顺序为提取温度>提取次数>提取时间>固料比，最佳提取工艺为：A2B3C1D2，即固液比为1∶20，提取时间为2.5h，提取次数为1次，提取温度为85℃，在此条件下多糖提取率达0.16 mg/g。

2.4.1 精密度试验

精密吸取样品溶液1.0ml，按“1.2.3”项下条件重复测定5次，吸光度的RSD=1.58%。

2.4.2 稳定性试验

精密吸取样品溶液1ml，按“1.2.3”项下条件操作，每隔20min测定1次吸光度，重复测定6次，RSD为 0.97%。表明在2h内供试品溶液稳定性良好。

2.4.3 重复性试验

取同一样品5份，按“1.2.3”项下条件平行操作，测得吸光度。RSD为1.05%，表明方法重复性良好。

2.4.4 加样回收试验

精密吸取样品溶液6份，均为 0.2ml，分别加入葡萄糖对照液 0.1、0.1、0.2、0.2、0.3、0.3ml，按照标准曲线方法测定吸光度，测得总生物碱的平均加样回收率为99.8%，RSD=0.49%。

3 结论

本试验通过单因素试验和正交试验优选出高山辣根菜中水溶性总多糖的最优工艺为：A2B3C1D2，即固液比为1∶20，提取时间为2.5h，提取次数为1次，提取温度为85℃，验证试验证明结果具有较好的重复性和精密度。