微流控芯片技术在抗深部真菌感染药物筛选中的研究进展

张晓莹，朱英霞 综述 孙慎侠 审校

大连大学医学院，辽宁 大连 116622

深部真菌感染是指致病真菌侵入机体内脏、皮下组织、皮肤角质层以下和黏膜所致的感染，严重时甚至可导致全身性感染[1]。据统计，人类的主要深部真菌病原体(白色念珠菌、烟曲霉和新型隐球菌)每年导致超过200万人感染，150万人死亡[2]。且深部真菌感染的发生率及死亡率仍呈逐年上升的趋势[3]。

对于许多浅表真菌病，在过去的一个世纪里已经研发了一系列的局部药物，在控制常见感染方面取得了一定的成功。相比之下，对于需要全身抗真菌治疗的深部真菌病，可用的抗真菌药物种类很少，目前主要有多烯类、嘧啶类似物、唑类和棘白菌素等。但这些药物存在着靶点少、抗菌谱窄、耐药性严重、副作用比较大等[4]问题。除此之外，抗真菌药物研发的进程比较缓慢。例如，从2000年到2015年，有18种首创药物被批准用于实体肿瘤癌症[5]。然而只有一种新的抗真菌药物—棘白菌素被引入。尽管一些广泛使用的高通量筛选平台可能会加强药物筛选进程，但它们的成本较高且无法准确模拟细胞药物间的相互作用，很难准确预测候选药物对人体的疗效和毒性。因此，构建一种既能模拟体内环境并且重复性高的体外药物高通量筛选模型具有十分重要的意义。

微流控芯片技术作为21世纪最先进的分析技术之一，已经成为目前药物筛选的有力工具。该技术将样品的制备、反应、分离、检测等操作均集成在微米级的芯片上，可以到代替传统生物化学实验室的许多功能[6]。近年来，该技术不断趋于微型化、自动化和集成化，并不断提高分辨率和灵敏度[7]。因此，该技术的通用性完全符合药物合成、筛选和测试的要求[8]。本文就近年来微流控芯片技术的发展及其在抗深部真菌感染药物筛选中的研究进展及应用前景做一综述。

1 微流控芯片技术简介

微流控芯片分析技术最早由TERRY等[9]于1979年提出，他利用光刻技术和化学蚀刻技术在硅片上制造了微型气体分析系统。1990年，MANZ等[10]将高效液相色谱技术集成在一张微小芯片上，将实验室常规分析方法集成到一个微型化操作系统中，使得多单元技术可以在微平台上灵活组合、大规模集成。与此同时，它可以创造可控的微环境，准确驱动和控制微流体在微通道中的流动，增加检测灵敏度，提高检测效率[7]。此外，微流控技术提供了在动态和明确的环境中研究单个微生物的方法，并在微生物的检测与抗感染方面得到应用[11]。因此，利用微流控芯片技术可以实现对真菌的深入研究，以达到更高的效率和精度。

2 传统抗深部真菌感染药物筛选方法

目前，常见的抗深部真菌药物筛选方法主要有体外和体内两种筛选方法。体外筛选实验以药敏试验最常用。体内筛选实验主要采用动物实验法—以动物为模型，预测候选药物对人体的细胞毒性、药代动力学及抗菌效果。

2.1 体外药敏试验筛选方法 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)药敏试验(AST)标准，AST可分为琼脂扩散法和稀释法[12]。通过这两种方法可以测定抗菌素的抑菌圈大小和最小抑菌浓度(MIC)，根据药敏分界点判定标准[13]判断菌株对抗菌素的敏感性。琼脂扩散法是一种半定量检测方法，通过抑菌圈的直径来判定药物敏感性。与其他方法相比，琼脂扩散法操作简单，成本低廉，无需特殊设备。但此试验仅限于半定量，时间长，不能及时报出药敏结果[13]；药物浓度、培养基类型、温度、pH值等都对抑菌圈有一定的影响[14]。稀释法是一种定量的检测方法,分为琼脂稀释法和宏量、微量肉汤稀释法。其中微量肉汤稀释法被称为药敏试验的金标准[14]，其操作步骤已经标准化，能够经济、有效、准确地定量测定出待检菌株的MIC。但该方法筛选速度极慢，手工步骤多、试剂消耗大，筛选效率达不到高通量筛选的要求。除了上述两种传统方法外，流式细胞术在抗真菌药物的高通量筛选中发挥着重要作用[15]，流式细胞术是一种对溶液中单个细胞进行快速多参数分析的技术。其作用原理是使用细胞活性标记物或荧光染料处理药物作用后的真菌细胞，如碘化丙锭(PI)，若细胞受损而死亡，PI可以进入细胞膜破坏的细胞，与细胞核中的核酸结合，通过流式细胞仪可以检测荧光信号从而判断细胞密度和损伤情况。流式细胞术操作简便、分析迅速，可用于高通量药物筛选，然而由于侵袭性霉菌菌丝在流式细胞仪中不易流动，故很难用于侵袭性霉菌药物筛选，常用于酵母型真菌尤其是念珠菌的药物筛选。以上几种体外药敏试验很难满足对于严重的中枢神经系统感染性疾病的药物筛选，主要原因是这类药物筛选需要考虑突破血脑屏障，有时通过体外药物筛选是有效的，但一旦进入临床体内药效试验就会出现疗效甚微或无效。

2.2 体内动物试验筛选方法 动物试验作为抗深部真菌感染药物发现的临床前试验，在预测药代动力学方面起着非常重要的作用。然而，啮齿动物、狗、猴等与人类存在底物特异性、组织分布和转运蛋白的相对丰富度等方面的差异，这往往导致药物-药物相互作用(DDIs)的风险评估不准确或药代动力学预测错误，因此一些候选化合物在临床试验之前就被放弃，大大影响了新药研发的效率及成本[16]。此外，整体的动物病理模型通常需要手工构建，对技术的要求较高，这使得动物试验周期较长，只适合低通量药物筛选。微流控芯片在药物研发中可以模拟人体体内组织、器官的生理功能，可以很好地避免动物试验带来的诸多问题，具有极好的重复性、较高的效率[17-18]。

3 微流控芯片在抗深部真菌感染药物筛选中的应用

传统的抗深部真菌药物筛选方法存在成本高、效率低下等问题。尽管一些广泛使用的高通量筛选平台可能会加强药物筛选进程，但它们的成本较高且无法准确模拟细胞-药物间的相互作用，因此很难准确预测候选药物对人体的疗效和毒性。近年来，微流控技术的引入大大提高了临床医学的药敏试验和耐药检测效率。微流控芯片的抗深部真菌药物筛选系统主要用于筛选治疗中枢神经系统感染的药物。尤其是新型隐球菌感染引起的脑膜炎。中枢神经系统(CNS)特殊的血脑屏障(BBB)结构会阻碍大部分药物由血液渗透进入脑部。且复杂的大脑组织结构易结合药物，使得许多药物难以到达靶向脑组织，极大地削弱了抗真菌药物的抗菌效果[19]。因此，在抗深部真菌药物研发的早期阶段就对药效指标进行评估至关重要，特别是评价其血脑屏障渗透率和对靶向脑细胞的药效。

近些年来，一些血脑屏障微流控芯片药物筛选模型逐渐被研发出来，此类模型能够逼真地模拟人体的血液流动、血管结构和共培养等生理微环境[20-21]。实现检测治疗CNS疾病的药物对血脑屏障的渗透率以及分析药物对靶向脑细胞的毒性。例如，KIM等[22]设计了一种BBB芯片用来测定某些药物的血脑屏障渗透率，其结果与体内药物动力学结果呈现出相关性。YEON等[23]为促进内皮细胞在芯片上形成紧密的内皮单层，应用具有多孔结构的栅栏结构捕捉内皮细胞，并以星形胶质细胞处理过的培养基孵育，药物渗透性试验表明，该模型测得的渗透性系数与体内模型测得的脑摄取指数有一定的相关性。邵晓剑[24]构建的BBB微流控芯片药物筛选模型主要由BBB模型、三维细胞培养室、微固相萃取柱芯片组成，结果表明模型药物的BBB渗透率以及药物在脑部组织中的扩散和作用效果与体内数据相似，且整个试验过程只需30 min，样品量为5µL。这对研究药物的渗透率和药物对靶向脑细胞的毒性分析具有重要意义。

与传统药物筛选方法相比，微流控芯片中进行的药物处理更敏感，因为芯片内经常补充新鲜介质和药物溶液，此外，同一芯片可设计不同孔道，实现不同浓度药物的同时给药。例如，QIANG等[25]设计微流控芯片包含成千上万的平行式微通道，微通道宽度从3µL到5µL不等。他们对50 520种新药进行了筛选，最终发现10种小分子化合物可以使两性霉素B对持久性白色念珠菌的抗感染作用增强30%以上[26-27]。这一发现可能为临床治疗难治性复发的白色念珠菌感染开辟了一条新的途径。BALTEKIN等[28]使用狭窄的微流控阱研究AST，能够在30 min内提供结果，该方法可以达到与标准方法相同的效果，但比传统方法快很多。因此，将微流控技术引入到临床医学的药敏试验和耐药检测中，可以大大提高检测效率。

此外，在微流控芯片的基础上发展出了一种新型的液滴微流控药物筛选平台，该技术采用非连续流动技术，使不相溶的水油两相相互作用，快速生成高度单分散的液滴。每个液滴都可以作为液滴微反应器[29]，可同时开展成千上万的反应。液滴大小与细胞大小相似，提供了更生理的、高生物相容性的微环境[30]。与连续流微流控芯片相比，液滴微流控芯片可增加通量，易混合，不易交叉污染。与传统孔板法相比，液滴微流控芯片以液滴包裹真菌作为微反应器，不仅可获得较高的菌落浓度，还大大缩短了真菌的培养时间[31]。

用液滴微流控芯片筛选抗真菌药物的基本过程为：将菌液、药物、荧光指示剂(在活细胞中能显示荧光信号)等一起包裹在液滴中，不同液滴所含药物浓度不同。通过检测不同液滴内的荧光信号，从而获得该药的抗真菌活性[31]。郑振[29]设计了一种液滴微流控芯片用于筛选抗白色念珠菌药物。他们选取4种抗真菌药物作为模型药物，以在活细胞中具有特殊荧光特性的阿尔玛蓝作为指示剂，采用96孔微孔板法验证液滴微流控芯片的可行性。结果表明,液滴微流控芯片平台可在2 h内准确、高效地完成抗真菌敏感性测试。在液滴微流控芯片的基础上，蔡颖[32]构建的浓度梯度液滴微流控芯片，该方法采用液滴微流控技术结合浓度梯度生成包裹白色念珠菌的芯片，分别测试了8种临床常用抗白色念珠菌药物的MIC范围。与普通液滴微流控芯片相比，浓度梯度液滴微流控芯片的优势在于，一次实验可以考察多种实验条件，进一步提高了药物的通量。

4 展望

本文综述了近年来用于抗深部真菌感染药物筛选的微流控芯片研究进展。微流控芯片技术可以实现细胞和真菌共培养，构建高通量、低成本的基于细胞水平的药物筛选系统，能够很好地解决传统药物筛选方法带来的诸多问题。液滴微流控芯片技术进一步发挥了传统微流控芯片的优势，这为抗深部真菌药物筛选提供了新的试验平台。然而目前开展的基于液滴微流控芯片的药物筛选试验尚处于初级阶段，且该技术在液滴分选、后续检测等方面还存在着一定的局限性。但随着液滴生成和操控技术的不断发展，相信未来的液滴微流控技术必将成为筛选抗深部真菌药物的有力工具，从而加快药物研发进程。