blaKPC耐药基因在肺炎克雷伯菌中的传播机制研究

贾阿韶 综述 余广超 审校

暨南大学附属第一医院临床检验中心，广东 广州 510630

KPC型碳青霉烯酶作为A类碳青霉烯酶中最常见的一种酶类，能够水解包括碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类抗菌药物[1]。blaKPC基因是KPC型碳青霉烯酶的编码基因，blaKPC基因的传播可以通过不同的分子机制来介导，通过可移动遗传元件(如质粒等)介导是其中很常见的一种传播机制，亦可由染色体介导或克隆等方式进行传播[2]。近期有研究发现，耐碳青酶烯肺炎克雷伯菌(CRKP)所导致的血流感染发生率和死亡率均呈上升趋势[3-4]。因此，从基因水平研究产KPC型碳青霉烯酶的传播机制对于控制和延缓细菌耐药性的传播具有重要意义。本文主要就blaKPC基因通过可移动遗传元件进行传播的相关研究做一综述。

1 质粒介导的blaKPC耐药基因传播机制

质粒是一种存在于染色体以外的核酸分子，具有自我复制以及在细菌之间进行转移的特征。质粒本身携带有一些特殊基因，可用于表达特定的功能，包括耐药基因、毒力基因等，虽然这些基因对于细菌的生存不是必要的，但其存在对于细菌适应生存环境的改变往往有所裨益[5-6]。耐药基因通过质粒介导的传播较之染色体更具有灵活性，传播速度也更快，这一特性使得携带KPC耐药基因的质粒更容易造成在肠杆菌科细菌间的水平传播，从而导致了产酶菌株的快速播散[7-8]。

质粒上存在各种抗菌药物的抗性基因，即耐药基因，这些耐药基因的积累是由于在多种抗菌药物的选择压力下各种复杂的移动元件水平转移事件导致的[9]。质粒作为介导耐药基因进行传播的一种媒介，其传播方式是多样的，通过质粒接合作用介导耐药基因的水平传播是其中最常见的一种方式，接合作用可以使得耐药质粒从耐药菌株成功转移至敏感菌株，这种转移方式不仅可以造成耐药基因在同种菌株间的快速播散，甚至可以造成不同种属间的快速播散[10-11]。质粒分子量大小不同，通过估算质粒的分子量大小，有助于研究耐药性质粒的传播及其进化的过程。肺炎克雷伯菌中KPC酶基因位于不同大小的质粒上，携有耐药基因的质粒可以从数十kb到数百kb不等，故此可以推断质粒在介导耐药基因进行水平传播的过程中很有可能出现了重组事件或插入事件，这种可能的存在导致质粒的水平转移可以从外界获得耐药基因，加快了质粒介导的耐药基因在细菌间的传播进程。

截至目前，据全质粒测序分析发现携带blaKPC耐药基因的质粒有近50种，KPC的blaKPC耐药基因最常见于IncF型质粒上[12]。希腊曾暴发过由IncFⅡK质粒介导的产KPC-2酶大肠埃希菌(ST410)的广泛流行，在此之前，该质粒曾介导过肺炎克雷伯菌在希腊的广泛传播[13]。有研究发现，肠杆菌中有4个属6个种的耐碳青霉烯酶肠杆菌的blaKPC耐药基因均存在于pUVA01质粒上[14]。介导blaKPC耐药基因传播的质粒具有广谱宿主性和多样性。

介导blaKPC耐药基因传播的质粒具有广谱宿主性和多样性，质粒的某些特性赋予了它更多的传播方式，使其介导耐药基因的传播过程也变得更容易，从而更易导致耐药菌的广泛流行。

2转座子介导的blaKPC耐药基因传播机制

转座子(Tn)是指能将自身基因插入基因组中任何一个序列的一组DNA序列，它可以在基因组上进行自由移动[15]。转座子可以介导β-内酰胺酶基因，通过水解β-内酰胺类抗生素，从而导致blaKPC耐药基因的水平传播[16]。

据流行病学调查报告表明，转座子Tn4401是欧美地区最常见的携带blaKPC的基因元件[17]。Tn4401转座子全长10 kb左右，其结构组成包括blaKPC-2基因、转座酶基因(tnp A)、解离酶基因(tnp R)和ISKpn6、ISKpn7两个插入序列。Tn4401序列两边有5 bp的靶位复制序列，可以携带着blaKPC以较高的频率插入到不同质粒的开放读码框(ORF)中，这就使得blaKPC耐药基因得以在相同菌种甚至不同菌种间实现快速播散，因此Tn4401被认为加速了产酶菌株的全球扩散[18-19]。不同于欧美地区，在我国，复合转座子Tn3-Tn4401和转座子Tn1721是国内产菌株最常报道的携带blaKPC耐药基因的基因元件，尤其是在江浙地区报道的菌株中经常出现。这种复合转座子被认为是基于Tn3的转座子和部分Tn4401结构的整合，其ORF顺序为：Tn3转座子的Tn3-转座酶和Tn3-解旋酶、ISKpn8、blaKPC-2基因和ISKpn6样元件，该转座子仅有2 070 bp的区域与Tn4401相同，包括blaKPC-2基因和类似ISKpn6的ORF[20]。位于复合转座子Tn3-Tn4401中ISKpn8插入序列下游的blaKPC-2耐药基因，往往是以Tn3-Tn4401复合转座子的整体形式进行转移，而非单独随ISKpn8一起移动[20]。Tn1721转座子是我国早期报道的与blaKPC基因传播有关的转座子，最近有研究表明，我国东部地区blaKPC-2基因主要位于2种Tn1721转座子亚型，其分别被命名为Tn1721A和Tn1721B；Tn1721A的结构与Tn1721B的不同之处在于Tn1721A不包含额外的IRL和IRL2等附加的反向重复序列[21]。无论blaKPC-2耐药基因是位于转座子内部还是外部，都可随Tn1721转座子运动，通过转座子插入到质粒中来介导耐药基因的水平传播，但相较于转座子Tn4401无特异性的插入位点，转座子Tn1721插入位点基因的周围环境表现为AT含量由两端向中间递减的趋势[21]，这表明转座子Tn1721的插入位点可能更具特异性。此外，有研究发现含blaKPC-3基因的Tn4401转座子可直接插入到一个复合转座子Tn1331中[22]。

携带KPC基因的Tn4401转座子可直接插入到质粒中进行传播，融入质粒的转座子结构大多保持了其自身的转座能力，同时也可以随质粒接合转移进行传播。这种传播方式在介导blaKPC耐药基因进行水平传播的过程中存在着至关重要的作用。

3 整合子介导的blaKPC耐药基因传播机制

整合子是存在于很多细菌中的一种具有运动属性的DNA分子，常定位于质粒、染色体和转座子上，其具有独特的结构可以捕获外源基因特别是耐药基因并稳定表达，以此来提高细菌对周围环境改变的耐受性。整合子可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子，intI1、intI2、intI3分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的遗传标记。研究表明，携带blaKPC基因的肺炎克雷伯菌对抗生素具有耐药性与Ⅰ、Ⅱ类整合子密切相关，与Ⅲ类整合子相关性不大[23-24]。blaKPC耐药基因以基因盒的形成位于整合子可变区，可随整合子在不同细菌之间水平传播。携带耐药基因的整合子随其他可移动遗传元件(如转座子等)融合到质粒上，从而介导耐药基因在不同菌株间发生水平传播。

4 插入序列介导的blaKPC耐药基因传播机制

插入序列(IS)是编码转座酶的一段DNA序列，大小一般在600～2 000 bp，可看成一种简单形式的转座子。有研究认为在转座子Tn4401的形成过程中，ISKpn6和ISKpn7分别插入到blaKPC上下游，破坏IRR1，从而形成一个完整的转座子Tn4401[19]，并随转座Tn4401转移到质粒上介导耐药基因的水平传播。

被插入序列插入的位点基因可因受损不再表达而导致基因失活，称为插入失活(insertional inactivation)[25]，从而使细菌产生对抗生素的耐药。甚至可因此而产生一种转座子突变体，如：国内曾报道了转座子Tn1721的突变体，就是由于IS26在Tn3的tnpA插入导致tnpA丢失，形成了一种Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26样的新结构[26-27]。

插入序列作为转座子的一部分，可携带blaKPC耐药基因随转座子转移到质粒上介导耐药基因的水平传播[28]，亦可导致插入位点基因的失活，形成一种转座子突变体，从而介导新的耐药机制的产生。

5 噬菌体/噬菌体原介导的blaKPC耐药基因传播机制

噬菌体在自然界中含量丰富，其结构简单，适应性强，容易在各种生存环境长期存活，因此它是耐药基因转移的最合适载体。噬菌体不仅可以介导耐药基因在同一种属细菌之间传播，还可以介导耐药基因的跨细菌种属传播，对细菌基因组的多样性和进化发挥了重要作用[28]。

目前已在临床肺炎克雷伯菌中发现了P7-like噬菌体并携带多黏菌素耐药基因mcr-1[29]。有研究报道，存在于菌体中的噬菌体原(prophage)可以帮助大肠埃希菌拮抗β-内酰胺类药物，这也许跟某些噬菌体原自身含有的耐药基因有关，也可能是通过菌体中的某些特定蛋白抑制细菌的细胞分裂，使得细菌对抗生素的敏感性下降，从而介导细菌产生耐药[30]。对于噬菌体原是否能通过类似机制来介导blaKPC基因进行广泛传播尚不清楚，噬菌体原介导耐药基因的传播机制需要进一步研究完善。

6 结语

blaKPC基因可以通过质粒、转座子、整合子等可移动遗传元件进行传播，blaKPC基因在不同地区的流行可通过不同的可移动遗传元件，或同种可移动遗传元件中不同类型的小元件进行水平传播，表明blaKPC基因环境与扩散转移可能存在地域差异。目前关于blaKPC基因的具体播散规律尚不完善，因此需要更多的相关研究进行深入探索。可移动遗传元件介导blaKPC基因水平传播所导致的CRKP全球播散给公共卫生造成了极大的威胁，耐药形势十分严峻。当前各级医院需加强院内感染的控制，合理使用抗菌药物，以及定期进行环境清洁和设备消毒。