临床病理学指标和分子生物学标志物评估胃肠道间质瘤预后的研究进展

李余轶 ,黄梦贻,2 ,陆新良

（1.浙江大学医学院附属第二医院消化内科，浙江 杭州 310009；2.浙江省慈溪市第六人民医院消化内科，浙江 宁波 315000）

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是消化道最常见的间叶组织源性肿瘤，可累及整个消化道，好发于胃和小肠，其中超过80% GIST 伴有v-kitHardy-Zuckerman4 猫科肉瘤病毒致癌基因同源物（v-kitHardy-Zuckerman4 of oncogenic gene homolog，KIT）或血小板源性生长因子受体α 多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA）基因功能获得性突变［1］。由于GIST 对放化疗敏感性低，手术是其主要治疗方式。自2002 年始，以伊马替尼（imatinib）为代表的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）开始获批用于不可切除性/转移性GIST 靶向治疗，患者总体预后获得极大改善。GIST 生物学行为复杂，临床上常使用危险度分层，即极低危、低危、中危和高危表示进展潜能与预后差异，同时作为靶向治疗及治疗年限选择的依据。然而以危险度分层评估预后及指导靶向治疗仍存在局限性。SCHMIEDER 等［2］基于558 例GIST患者术后生存分析结果显示：危险度分层放大了极低危和低危患者的生存差异，而忽略了高危患者群体间的预后异质性。同时，CAMERON［3］研究显示：随着对靶向治疗年限的深入研究，当前危险度分层标准无法界定延长治疗的指征，因为并非所有高危患者均适合且必须延长治疗年限。故寻找有应用前景的预后标志物，对于评估患者进展潜能及生存风险，指导合理化的临床实践十分重要。

除了经典的预后临床病理指标（肿瘤最大直径、核分裂象、转移和破裂等），近年来，分子生物标志物在肿瘤诊断、靶向疗效和预后评估方面的意义开始受到广泛关注。GIST 中基因突变类型、微小RNA（miRNA）的过/失表达和增殖代谢相关蛋白水平等也显现出与进展风险较强的相关性及预后预测价值。CHEN 等［4］基于GIST 患者临床病理特征与肿瘤增殖抗原（Ki67）构建的生存列线图的研究显示出其较传统危险度分层标准更强的预测效能，结合临床病理特征和有效的分子生物标志物可能会对GIST 进展风险及预后有更精准的判断。虽已有综述［5］介 绍GIST 预后相关的DNA 和miRNA 分子，但未见针对GIST 预后临床病理及生物分子标志物的综述，以及关于其潜在的临床应用价值。现针对近年来GIST 预后相关研究进展作一综述，为GIST 患者精准化和个体化的治疗决策提供依据及思路。

1 GIST 的临床病理指标和应用价值

1.1 危险度分层肿瘤最大直径（≤2 cm、2 cm＜最大直径≤5 cm、5 cm＜最大直径≤10 cm 及＞10 cm）和核分裂象（≤5/50 HPF 和＞5/50 HPF）是各类危险度分层标准共同参数，是评估疾病恶性进展风险的基础。随着小GIST 检出率的增加，国内研究者开始关注利用肿瘤最大直径评估小GIST进展潜能，进而规范随访时间。GAO 等［6］研究发现：肿瘤最大直径＜9.5 mm 的GIST 患者2 年内进展（长径增加≥1.2 倍）的概率小于5%，而肿瘤最大直径＞9.5 mm 患者1 年内进展概率大于30%，建议将肿瘤最大直径＞9.5 mm 的小GIST 患者随访时间延长至2～3 年，肿瘤最大直径＜9.5 mm 的GIST 患者每6～12 个月需进行内镜随访。但目前小GIST 进展最大直径界值仍有波动，另2 项相关研究［7-8］确定的小GIST 进展最大直径界值分别为1.40 和1.45 cm，尚需大样本数据研究加以明确。核分裂象是公认的GIST 预后最重要的影响因素，然而核分裂象＞5/50 HPF 的高危型GIST 预后仍有差异，一项纳入246 例高危胃间质瘤的研究［9］显示：核分裂象＞20/50 HPF 患者的总体生存（overall survival，OS）率明显低于（6～20）/50 HPF 人群（0%vs82.8%，P＜0.01），因 此可在核分裂象＞5/50 HPF 人群进一步分层，以确定极高危者作为延长伊马替尼治疗的合适人群。

2006 年MIETTINEN 等［10］将肿瘤位置作为危险度评估的指标（AFIP 标准），在肿瘤相同大小及核分裂象分层中，胃源性间质瘤危险度级别更低，术后有更长的缓解期，而小肠和结肠来源的间质瘤多数体积大，与周围组织粘连，伴发器官或者组织转移，易于复发，预后不佳［10-11］。在AFIP 标准基础上，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）加入肿瘤破裂这一参数形成改良NIH 标准［12］。肿瘤破裂即被归类为高危型，是辅助治疗的指征［13］。目前关于肿瘤破裂的定义延续Oslo 标准［14-15］，即肿瘤破损或肿瘤组织溢出、分块切除、切取活检、血性腹水、肿瘤并发胃肠道穿孔和毗邻组织肿瘤微浸润等肿瘤完整性的大缺损，而空心针活检、肿瘤浆膜侵犯、肿瘤表面黏膜破裂和R1 切除等肿瘤完整性的小缺损不属于肿瘤破裂。另外该项研究［15］结果还显示：大缺损（破裂）、小缺损和无破裂患者5 年无复发生存（recurrencefree survival，RFS）率分别是37%、91% 和96%，即使在接受伊马替尼治疗的条件下，肿瘤破裂患者仍面临极高复发风险，而小缺损无论发生在胃或肠中，对预后影响均可忽略。因此破裂形式的严格划分，对于精准评估预后及规避过度医疗非常必要。

1.2 肿瘤转移肿瘤转移提示肿瘤进展和预后不良。基于美国国立癌症研究所SEER 数据库的研究［16］结果显示：肝转移在GIST 中最常见，肝、肺和骨转移的患者OS 及肿瘤特异性生存（cancerspecific survival，CSS）期较相应的非转移者明显缩短，且多个部位并发转移者预后更差。在转移性GIST 中，寡转移灶（转移灶≤3 个）是一种预后相对较优的特殊亚型，类似于高危局灶型GIST，新辅助治疗后完全切除率增加，患者5 年和10 年生存率（分别是89%和71%）远高于非寡转移GIST（分别是38%和20%）（P＜0.01）［17］。SATO 等［18］研究结果表明：单个器官或者系统的转移瘤，数量小于4 个且最大直径不超过10 cm，伊马替尼联合局部治疗可改善患者预后。目前转移性GIST 手术指征尚未明确，大样本荟萃分析［19］结果提示：对于转移或者复发GIST，与伊马替尼单独治疗比较，手术联合伊马替尼治疗的患者能够获得更长的OS及RFS 期。然而这种获益是否源于手术本身仍待研究，基础情况、年龄和外科医生手术意愿均会对治疗方式产生影响［18］。更多的研究证据［20］表明：对于伊马替尼反应型的转移病灶，完全切除易于实现，积极手术干预会延长无进展生存（progressionfree survival，PFS）期，并且延缓部分患者转二线靶向治疗的进程。

1.3 手术切缘手术切缘常决定着追加手术或者辅助化疗方案的选择，依据切缘可将手术切除分为肉眼可见肿瘤残留（R2）、显微镜下有残留（R1）和显微镜下无残留（R0），明确的R2 切除会增加术后复发和转移的风险，缩短术后OS［21］。关于R0 和R1 切除对术后生存期的影响是术者关注的热点。术前新辅助化疗增加了瘤体完全切除的比例，但常由于考虑保留重要器官功能，减少对邻近组织和血管的损伤，不可避免出现R1 切除。一项针对可切除胃间质瘤的大宗数据（n=2 084）分析［22］，结果显示：R0 切除与R1 切除对于5 年OS 率影响差异无统计学意义（82.5%vs88.6%，P=0.49），且R1 切除本身与肿瘤大小、肿瘤破裂及危险程度有关，上述固有病理学特征决定着腹膜和血行播散的风险。这与HØLMEBAKK 等［23］的研究结论一致，在没有其他高危肿瘤特征的情况下，不支持仅根据镜下边缘状况进行特异性辅助治疗。PANTUSO 等［24］研究结果显示：R1 和R0 切除对于GIST 患者OS 及复发影响差异无统计学意义，因此当R0 切除可能出现功能性后遗症时，尤其是对于低风险的肿瘤则可选择R1 切除。在一项随机对照研究［25］中，908 例中高危GIST 患者在接受手术后被随机分配到伊马替尼组（400 mg·d－1，2 年）和观察组，经过8～10 年随访，结果显示：无论术后是否接受辅助治疗，肿瘤破裂是恒定的加速疾病进展和复发的危险因素；除外肿瘤破裂患者，2 组中R1 切除与R0 切除对于术后RFS 及OS 期影响差异无统计学意义。综上，无瘤是GIST 手术首要原则，应尽可能避免医源性破裂的发生，而R0 或R1切除本身不应作为实施辅助治疗的标准。

2 与预后有关的分子生物学标志物

GIST 的临床病理特征能从宏观角度反映其侵袭性、进展趋势和死亡风险，从分子生物学角度，肿瘤的进展和预后是由基因突变、遗传调控和差异表达等多种内在微观过程共同决定的。

2.1 KIT/PDGFRA 基因突变GIST 基因突变最常见的位点在KIT 外显子（11、9、13 和17）和PDGFRA 外显子（18、12 和14），10%～15% 的GIST 无KIT 或PDGFRA 突变，称为野生型GIST［26］。其中KIT 突变的GIST 患者预后相对最差，KIT 突变型常出现在非胃源性、肿瘤体积大，核分裂象高的GIST 中，其复发率与转移率较非KIT 突变型明显增加（P＜0.01），OS 率降低（P=0.02）［27］。PDGFRA 突变型中最常见的是对伊马替尼原发耐药的外显子18 D842V 型，其好发于胃，同时多出现在低核分裂象中，故复发风险低；而非D842V 突变型GIST 对伊马替尼敏感，可从伊马替尼治疗中获益［27-28］。ROSSI 等［29］纳 入451 例未接受任何辅助和新辅助治疗的原发局限型GIST，发现基因分型对于GIST 自然预后有影响：鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1 突变型（BRAF）、PDGFRA 外显子12 和KIT 外显子13 突变型GIST 患者预后较好；三阴性GIST、PDGFRA D842V、KIT 外显子17 和PDGFRA 外显子14 突变型GIST 患者次之；KIT 外显子9、KIT 外显子11 和PDGFRA 外显子18（除D842V）突变型GIST 患者预后最差。在使用伊马替尼后，由于基因突变分型决定着对靶向治疗反应性差异，使得干预预后与自然预后不符。研究［30］显示：KIT 突变发生在外显子11 区会对伊马替尼产生更强的应答反应，使得在常规剂量治疗下，该型较外显子9 突变及野生型GIST 的OS 延长20 个月，并且获得更有效的缓解率。同时为了降低外显子9 突变型GIST 患者的复发率，指南［13］推荐增加剂量 为800 mg·d－1。在KIT 外显子11 突变中发现侵袭性极强的一种亚型，即第557/558 密码子删失突变，此型突变超过80% 为高危型，其5 年RFS（23.8%）明显低于该区其他密码子的点突变（41.8%，P＜0.01）和缺失突变（33.3%，P=0.007），故对于此种类型的患者有必要延长靶向治疗年限并缩短随访间隔时间［31］。而对于KIT 外显子11 重复突变及单个密码子的缺失突变，仅手术治疗能得到良好的RFS 获益，术后同等级别的伊马替尼治疗可能导致过度治疗［32］。

2.2单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）除了基因突变，SNPs 及表观遗传现象均与GIST 的结局有关。SNPs 是在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的序列多样性。研究［33］提示：血浆伊马替尼谷浓度低于1 100 mg·L－1会降低疾病缓解率，缩短从治疗到复发的时间。因此与伊马替尼药物动力学和药物代谢过程相关酶的SNPs 将会影响药物浓度及药效，进而影响GIST 进展及生存［34-35］。ATP 结合盒超家族转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）是一种参与到细胞药物外排过程且与耐药性的产生相关的蛋白，研究［36］显示：ABCG2 基因421 号位点AA 基因型GIST 患者5 年PFS 率（92.3%）高 于CC/CA 基因型（65.0%，P=0.047）。在54 例接受伊马替尼治疗的晚期GIST 患者中，药物内流转运体溶质载体家族（solute carrier family，SLC）中SLC22A4（rs1050152）和SLC22A5（rs2631367 和rs2631372）的SNPs 提示了伊马替尼治疗进展时间间隔将会延长［37］。另一项研究［38］进行了伊马替尼代谢相关的27 个SNPs 与GIST 预后相关性分析，结果显示：VEGFR2 基因（rs1870377）AA 型、VEGFA 基因（rs1570360）AA 型 和SLCO1B3 基因（rs414911）T 等位基因是明确不利的预后因素，其对应患者PFS 明显短于变异型GIST 患者。SNPs 不仅参与伊马替尼代谢调控，KIT 外显子10 第1 621 位密码子发生A-C 转换后，患者对伊马替尼的反应及其效果未受影响，但其能使原编码蛋氨酸被亮氨酸取 代，最终会增加磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的活性，导致患者5 年内复发率较其他基因型患者升高，且常伴有肿瘤的局部或远处转移等侵袭行为发生［39］。此 外，ANGELINI 等［40］对比分析了60 例GIST 患者与153 名健康对照者中叶酸代谢酶相关的13 个基因SNPs 与患者预后的关系，发现还原性叶酸载体蛋白（reduced folate carrier，RFC）AA/AG 基因型及羟甲基转移 酶（serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1）CC/CT 基因型分别与GIST 进展速度及OS 具有相关性，但具体机制尚未明确，其机制可能是由于叶酸代谢通路中关键基因的多态性引起蛋白功能发生变异，影响一碳单位的供给，最终使DNA 合成、修复和甲基化出现异常。

2.3 表观遗传调控表观遗传差异会引起同种突变型呈现不同的生物学进程，DNA 甲基化和非编码RNA 调控是重要的参与GIST 表观遗传修饰形式。研究［41］显示：CD133 的表达在GIST 中受到DNA 甲基化调控，且甲基化程度与肿瘤基本特征有关，在胃源性、肿瘤最大直径超过10 cm 和KIT突变的GIST 患者中，CD133 甲基化程度降低而CD133 表达水平升高；生存分析提示CD133 高表达患者无病生存期（disease-free survival，DFS）更短（P=0.007），在亚组分析中，低水平的CD133 甲基化预示更短的DFS 期（P=0.046），因此CD133 甲基化程度及其表达水平可能成为GIST的预后标志。HALLER 等［42］对GIST 靶向DNA甲基化谱及全基因组mRNA 表达进行对比分析，结合141 例GIST 患者的随访数据，分析结果显示：分泌型焦磷酸蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）的非CpG 岛启动子中单个CpG 二核苷酸的甲基化与患者预后有关，将SPP1甲基化水平分为低（＜25%）、中（25%～75%）和高（＞75%）组，随着SPP1 甲基化水平的升高，患者DFS 期明显缩短（P＜0.01）。miRNA 是内源基因编码的非编码链RNA 分子，miRNA 自身的表达及其水平会影响到靶基因表达，其主要通过与靶基因的3'-UTR 结合进行转录后调控。在转移或复发型GIST 中miR-186 表达水平会下降，芯片分析结果［43］显示：miR-186 低表达将会对一些肿瘤转移相关基因产生去抑制作用从而增加GIST 复发和转移的风险，预示着更短的OS 期（P＜0.05），故miR-186 表达水平可能是反映疾病进展及预后的潜在标志。miR-148-3p 可通过靶向结合KIT mRNA 3'-UTR 从而下调下游细胞外调节蛋白激酶（extracelluar regulated protein kinase，ERK）、丝氨酸/苏氨酸激酶（PKB）和信号传导与转录激活因子3（signal trasduction and trascription activator 3，STAT3）表达，从而抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移。因此miR-148-3p 可以被视作肿瘤抑制因子，一旦其作用削弱，患者的OS和DFS期将会缩短［44］。LONG等［45］对比分析GIST 肿瘤及癌旁组织分子表达水平，结果显示：miR-374b 在肿瘤组织中呈高表达，且表达水平与肿瘤的分期呈正相关关系，其主要通过下调第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）表达引起下游PI3K/PKB 通路激活，故miR-374b 表达水平也是反映GIST 进展的重要参考。应用miRNA 作为常规临床检测仍需要大规模数据验证，但是寻找特异度高的miRNA 不仅能够增强GIST 恶性潜能与预后预测的准确度，通过小干扰RNA 和反义寡核苷酸修饰miRNA 表达，将会使其成为有力的抗肿瘤靶点。

2.4 其他分子标志物①Ki67 是反映细胞增殖活性的核抗原，主要表达在细胞周期的M 期，在G1期和S 期微量表达，尽管不具有特异性，但Ki67 表达水平即Ki67 标记指数（Ki67 labeling index，Ki67LI）可被用于GIST 高危人群的预后分层，当Ki67LI＜6% 时，患者OS 率明显高于Ki67LI＞6%（88.7%vs53.6%，P=0.001）［46］。另有研究［47］提示：当Ki67LI 超过8%，高危患者使用伊马替尼疗效获益和RFS 明显降低（P分别为0.045 和0.018）。Ki67 具有与核分裂象类似的应用价值，即可用于辅助划分“极高危”型GIST 以作为延长伊马替尼治疗的指征，但仍需进一步明确最佳分组界值。②Raf 激酶抑制蛋白（Raf-1 kinase inhibitor protein，RKIP）属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，通过抑制MAPK 通路从而抑制肿瘤增殖与分化。在转移性GIST 患者中，RKIP 倾向于低表达甚至不表达，而RKIP 阴性表达的患者疾病特定生存期（disease-specific survival，DSS）较RKIP 阳性表达者更短［48］。WANG 等［49］通过对63例GIST 患者术后的随访资料分析发现：RKIP 阳性表达患者（n=34）1 年、3 年和5 年OS 率分别是94.4%、89.2% 和80.5%，而RKIP 阴性表达患者（n=29）分别为88.6%、68.2% 和48.2%（P=0.001 5），因此RKIP 可作为GIST 预后的一种保护性因素，诱导RKIP 的表达可能呈现潜在的抗瘤价值。③B 细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点1（B-cell specific moloney murine leukemia virus intergration site-1，BMI-1）蛋白也可作为GIST 的独立预后因子，其是肿瘤干细胞自我更新及分化过程中重要的调控蛋白。在GIST 患者中，BMI-1 可通过抑制抑癌基因产物p16 Ink4A 和p14 ARF 的表达从而上调细胞周期蛋白D1（CyclinD1）及细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependent kinases 4，CDK4）的表达，促进肿瘤增殖、侵袭和迁移［50］。在肿瘤直径大、危险度分级高、发生浸润或转移的GIST 患者中，BMI-1 阳性表达率及表达水平明显升高，且BMI-1 表达水平与生存期呈正相关关系（HR：4.319，95%CI：1.010～18.478，P=0.049）［51］。④既往研究［52-53］明确了钙激活通道蛋白1（calcium activated chloride channel 1，ANO1），又称DOG1 蛋白，在GIST 中的诊断价值，尤其是对于CD117 阴性GIST 患者。RIZZO 等［52］发现：DOG1 可作为潜在的危险度分层及预后相关指标，DOG1 阳性表达患者2 年的RFS 率明显低于DOG1 阴性表达患者（P=0.02），并且DOG1 强表达患者的复发率更高，预后更差。JUNG 等［54］研究发现：DOG1 阴性表达患者复发及转移风险增加。有研究者提出因外周血中DOG1水平检测简便、有效并实时地反映病情进展，可作为“液体活检”的替代，当病灶被手术切除或者伊马替尼治疗有效时，血液中DOG1 的表达水平会下降或者呈阴性表达，若疾病复发则DOG1 表达水平增加或转阳性表达［53］。但是鉴于DOG1 与疾病进展及预后的相关性存在争议，以DOG1 表达替代液体活检距离临床应用仍充满挑战。

3 总结与展望

综上所述，肿瘤最大直径、核分裂象、肿瘤位置和肿瘤破裂作为危险度分层的基本参数，是明确的GIST 预后相关危险因素。并且随着研究的深入，其展现了更多的应用价值，如以肿瘤最大直径规范小GIST 随访间隔，以核分裂象进一步划分“极高危”型GIST 作为延长伊马替尼治疗的指征等。肿瘤转移与R2 切除亦是被广泛认可的不良因素，尽可能完整切除转移灶、实现术中无瘤有望改善患者预后。除此之外，KIT/PDGFRA 基因突变、伊马替尼代谢相关的基因SNPs、DNA 甲基化、各种miRNA 及其他分子标志物将为评估GIST 进展潜能、靶向治疗效果及预后提供一定的参考依据。联合生物分子标志物与临床病理特征将会对GIST 患者复发风险及生存预后有更加准确的判断，同时寻找特异性的miRNA 或蛋白分子标志物也可能为GIST 精准治疗提供新的靶点。