NLRP3炎症小体在缺血性脑损伤中作用的研究进展

田明巧，官劲帆，安露露 综述 韩江全 审校

遵义医科大学第五附属(珠海)医院神经内科，广东 珠海 519100

目前脑卒中已经是我国致死率第一位的疾病，与缺血性心脏病、支气管肺癌并称为我国健康的三大杀手[1]，而脑卒中的患者中大约70%为脑梗死[2]。脑梗死发生后，除超早期的血管内治疗外，尚无其他明显有效的治疗措施，因此，发现和寻找治疗脑梗死的新靶点仍是脑梗死防治研究中的重点。炎症小体是一种大分子复合物，可在感受到细胞内各种刺激后进行组装，炎性小体的组装引起天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)激活，从而促进具有生物活性的白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)的分泌，并诱发称为焦亡的炎性细胞死亡[3]。炎性小体的效应器有效地驱动免疫反应，并介导脑梗死发生后无菌性炎症反应过程的控制。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3[nucleotide binding and oligomerization(NOD)-like receptor pyrin domain containing-3，NLRP3]炎症小体是最早发现的炎症小体之一，研究表明通过抑制NLRP3炎症小体激活可以减轻梗死后神经细胞的缺血性损伤[4]，因此对NLRP3炎症小体在缺血性脑损伤的作用及其机制做一综述。

1 NLRP3的概述

免疫系统是宿主防御的重要组成，种系编码的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)参与激活免疫系统，以应对入侵的病原体、死亡细胞或环境刺激物的有害刺激[5]。PRRs识别由内源性应激产生的独特微生物成分，称为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并触发下游的炎症通路，以消除微生物感染和修复受损组织[6]。炎症小体是一组激活炎症性Caspase-1的胞内多聚蛋白复合物，由其敏感蛋白(一种PRR)定义，PRR寡聚形成亲Caspase-1的活化平台，以应对DAMPs或PAMPs。已有4个PRRs成员被明确证实可以形成炎性小体：NLRP1、NLRP3和NLRC4，以及黑素瘤缺乏因子2(absent-in-melanoma2，AIM2)[7-8]。

2002年MARTINON的团队最早发表了关于NLRP3炎症小体的概念，当时他们揭示了组织损伤、先天免疫过程和Caspase-1依赖性反应之间的关键联系[9]。NLRP3炎症小体通常有三种主要成分：NLRP3受体蛋白、Caspase-1酶和促进两者相互作用的凋亡相关斑点样蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]。NLRP3是最典型的炎症小体传感器分子，由人类的22个基因家族编码，是NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)家族的三方蛋白质，包含一个氨基末端的热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)、一个核苷酸结合的中央NACHT结构域和一个亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)[10]。ASC蛋白由PYD和羧基末端的CARD组成，相比之下，Caspase-1具有一个CARD域、一个中央大催化域和一个羧基末端的小催化亚基域，NLR蛋白的LRR结构域被认为能够抑制炎性体的自激活[11-12]。在稳定状态下，LRR结构域折回到传感器分子的NACHT结构域上，该结构被认为具有NLRP3活性基础的三磷酸腺苷酶功能。在适当的刺激进行感测和激活后NLRP3发生寡聚，并通过两种蛋白PYD之间的相互作用进一步募集ASC，促使螺旋形ASC细丝形成，并组装成一个大的ASC斑点结构[13-14]。在形成ASC斑点后，Caspase-1通过同型CARD-CARD相互作用被募集，从而使邻近诱导的Caspase-1自我切割，并通过在p20-p10接头区域的切割而激活[15]。活跃的Caspase-1诱导IL-1β和IL-18的失活前体形式蛋白水解成为它们的生物学活性形式，Caspase-1也将消皮素D裂解成其活性N端片段，从而诱导一种称为焦亡的炎症形式的细胞死亡[16-17]。

2 NLRP3炎症小体在缺血性脑损伤中的作用

脑梗死是一种急性疾病，其特征是流向脑组织的血流量突然减少，导致神经功能受损或丧失。脑梗死后，多种机制参与缺血性脑损伤，包括生物能衰竭、细胞稳态丧失、细胞内钙水平升高、活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的毒性、花生四烯酸产物的产生、神经元和神经胶质细胞的活化、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏和白细胞浸润等[18]。其中炎症反应是缺血性损伤的重要环节，在脑梗死的整体发病机理中起重要作用，最初是导致缺血性脑损伤，然后是组织再生。最近的研究提供了新的炎症机制的思路，神经元和神经胶质细胞质膜上的PRRs激活某些炎症信号通路，促使脑梗死缺血核心带坏死细胞释放内源性DAMPs的反应，导致促炎性细胞因子的产生增加和NLRP3炎症小体介导的神经元和神经胶质细胞死亡[19]。在小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，缺血侧脑组织NLRP3的mRNA和蛋白表达显著上调，持续升高超过48 h，NLRP3表达增加的同时又进一步加重脑缺血损伤，而给予免疫球蛋白可抑制NLRP3活化发挥抗脑缺血性损伤作用[20]。NLRP3的活化不仅存在于神经元中，也存在于星形胶质细胞和小胶质细胞中，减少NLRP3的活化，能抑制星形胶质和小胶质细胞的激活，降低促炎因子的水平，从而减轻炎症反应[21]。此外，NLRP3炎症小体介导脑缺血的BBB损伤，通过抑制NLRP3炎症小体能减轻脑缺血后BBB的损伤，这与增强紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达有关[22]。新近大量的研究证实，通过抑制NLRP3的活化可改善缺氧缺血细胞模型和脑梗死动物模型中的缺血性损伤和神经血管并发症[23]。

促进IL-1β和IL-18的释放以及诱导细胞焦亡是NLRP3炎症小体参与机体糖尿病、动脉粥样硬化和心室重塑等多种病理过程的重要机制，激活NLRP3炎症小体加剧脑缺血损伤也与促进IL-1β和IL-18释放以及细胞焦亡密切相关。IL-1β和IL-18是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，在炎症反应中起重要作用，它可能是大脑的一线免疫防御，主要由人类的巨噬细胞和单核细胞分泌，并加速与自身免疫、炎症和感染相关的各种适应性和先天免疫过程[24-26]。许多神经系统疾病共有的细胞损伤机制均与IL-1β和IL-18的有害性相关，缺血性脑损伤发生后IL-1β和IL-18介导谷氨酸兴奋毒性与氧化应激反应，从而破坏细胞外基质和BBB，加剧脑水肿，最终导致神经元和胶质细胞死亡[19]。NLRP3炎症小体在脑梗死发生后被迅速激活，通过上调caspase-1水平增强IL-1β和IL-18的表达，使梗死体积增大和加重缺血性脑损伤[26]。FANN团队最新研究中，通过体内实验诱导小鼠脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤模型，在体外实验中对原代皮质神经元细胞进行氧葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGDR)模拟I/R，并同时对缺血侧脑组织和OGDR皮质神经元细胞中NLRP3炎症小体的蛋白水平及炎性成分进行分析，发现脑组织及神经元细胞中NLRP3蛋白以及IL-1β、IL-18的水平显著增加，而利用Caspase-1抑制剂治疗可在实验性I/R模型中通过下调IL-1β和IL-18的水平保护体外培养的皮质神经元细胞[27]。

细胞焦亡是依赖于炎症反应的程序性细胞死亡的一种模式，对于体内清除病原体是必不可少的，其两个标志性特征是DNA损伤和膜破裂，前者类似于细胞凋亡，而后者则完全相反[4]。当机体受到毒性刺激时，有害的胞内和胞外信号通过依赖于Caspase-1的经典焦亡途径诱导胞浆内炎性成分的形成，其主要与非感染性炎症有关，脑梗死属于典型的非感染性炎症[28]，因此Caspase-1在脑梗死后的细胞焦亡过程中具有重要作用。Caspase-1在神经元、活化的星形胶质细胞及小胶质细胞中表达，并且通过抑制Caspase-1表达能使神经细胞免受脑梗死的缺血性损伤[29]。细胞焦亡主要发生于脑梗死缺血半暗带，缺血核心区域的坏死细胞分泌能引发炎症介质的危险信号DAMPs，从而加剧细胞肿胀，加速脑细胞死亡。研究发现，在SD大鼠I/R模型中，通过检测缺血海马及皮质区细胞焦亡，其结果显示缺血侧在造模后12 h和24 h两个时间点细胞焦亡阳性率最高，证明细胞焦亡在I/R后神经细胞损伤中具有重要作用[30]。而且在I/R的体内和体外模型中，NLRP3炎症小体表达显著升高并诱导神经元细胞焦亡增加，进一步加重神经功能损伤，而靶向抑制NLRP3炎症小体活化后，神经元细胞的焦亡表现明显改善[31]。总之，NLRP3炎症小体主要是通过增加下游的IL-1β和IL-18释放以及诱导神经细胞焦亡，从而加剧缺血性脑损伤后炎症反应、加速BBB破坏以及促进氧化应激反应的发生等病理过程的发展。

3 缺血性脑损伤中NLRP3炎症小体激活的潜在调控机制

3.1 嘌呤能离子通道型7受体(purinergic ligand-gated ion-channel7receptor，P2X7R) P2X7R是嘌呤能2型受体家族的配体门控离子通道，由嘌呤2型G蛋白偶联受体(P2YG)和嘌呤2型X受体(P2X)7组成，能被细胞外ATP(extracellular ATP，eATP)封闭，允许阳离子非选择性地通过，而毫摩尔浓度的eATP持续刺激其触发非选择性孔形成，从而允许高达900 Da的分子通过，Na+和Ca2+内流以及K+外排导致细胞离子稳态的变化；此外，P2X7R可以通过其固有的成孔能力与泛连接蛋白半通道的结合来引发大规模细胞内ATP的释放，从而促进嘌呤能信号传导和炎症反应[32]。细胞内离子改变在NLRP3激活中的重要作用已经得到支持，P2X7R和NLRP3炎症小体能在分离的细胞质下相互作用，细胞膜通道的开放导致胞内K+减少，增强了NLRP3与NEK7蛋白的相互作用，而NEK7蛋白是不可缺少的NLRP3激活剂，除此之外，P2X7R刺激还产生了其他触发NLRP3活性的物质，如ROS和组织蛋白酶[33]。NLRP3炎症小体是P2X7R调节脑损伤后炎症潜在的信号分子，通过激动P2X7R可以使NLRP3激活促进脑组织中的炎症反应[34]。还有研究表明，在小鼠MCAO模型和缺血缺氧体外模型中进行蛋白印迹分析，发现缺血脑组织中P2X7R以及NLRP3炎症小体成分显著增加，利用P2X7R拮抗剂BBG阻断P2X7R可以减轻神经系统损伤以及抑制梗死后缺血侧神经元凋亡，并保护培养的皮质神经元免受缺血缺氧诱导的体外损伤，同时缺血侧脑组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的表达显著降低，由此推测该神经保护作用与拮抗P2X7R从而减少NLRP3炎症小体活化密切相关[35]。

3.2 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) MAPK是一组能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，MAPK家族由细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和P38蛋白三个亚族组成，各种应激因素刺激MAPK途径通过G蛋白偶联受体激活三层Raf/MEK/ERK级联反应，而且应激激活的MAPK在能扩大炎症的级联反应加重组织损伤[36]。最新研究发现，P38 MAPK激活可促进巨噬细胞中NLRP3炎性小体多个方面的功能，包括前体IL-1β的转录启动、NLRP3受体合成、NLRP3炎性小体复合物的激活以及分泌的IL-1β的下游炎症信号的传导[37]。脑梗死发生后，缺血侧神经元中发生MAPK信号的激活，其不利于神经元的存活，并且MAPK的药理学抑制作用可保护神经元在缺血条件下免受凋亡性细胞死亡。通过证实，在局部缺血条件下，MAPK介导的神经损伤作用与NLRP3炎症小体的激活有关，在神经元中抑制MAPK的表达可以降低外周免疫细胞中NLRP3蛋白活化从而改善缺血性神经细胞死亡[20]。除此之外，炎症反应是缺血性脑损伤BBB破坏的主要原因，BBB的破坏进一步引起继发性损伤和功能障碍，增加出血的风险并限制组织的恢复，但是通过抑制MAPK减少NLRP3炎症小体的表达可以使脑缺血后BBB的分解得到改善[22]，从而改善脑缺血后神经功能损伤。

3.3 核因子E2相关因子-2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路 Nrf2/ARE信号通路在细胞抗氧化和抗炎反应中起着至关重要的作用，一般情况下，Nrf2被Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)隔离在细胞质中，Keap1被激活后释放Nrf2并转移到细胞核中，在其中与ARE结合从而促进下游靶基因如醌氧化还原酶(NQO1)的转录。Nrf2/ARE调节细胞抗氧化和抗炎防御系统中涉及的200多种内源性保护基因，包括Ⅱ期抗氧化剂/排毒酶基因以及抗炎共刺激基因和分子伴侣基因，这些保护性基因在提高组织抗氧化能力以及发挥抗毒素、抗炎和抗凋亡作用中起着重要作用[38]。Nrf2/ARE的抗炎作用与在炎症反应过程中抑制NLRP3炎症小体激活密切相关，通过依赖Nrf2的方式激活ARE来诱导NQO1表达，可以抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化、Caspase-1裂解和IL-1β生成[39]。氧化应激是炎症反应的常见特征，在缺血性脑损伤病理过程中起关键作用，作为靶向Nrf2/ARE的基因，NQO1被认为是可调节的ROS产生的诱导性细胞保护基因，在通过OGDR诱导的BV2小胶质细胞体外模型中，激活Nrf2/ARE信号通路能增强NQO1的表达从而清除ROS，同时降低OGDR诱导的BV2小胶质细胞中NLRP3、ASC和Caspase-1的表达，表明激活Nrf2/ARE信号通路减少NLRP3炎症小体表达从而改善脑缺血损伤氧化应激和炎症反应，因此，Nrf2/ARE信号通路可能是抑制NLRP3炎症小体激活发挥治疗缺血性脑损伤的潜在靶标[40]。

4 展望

NLRP3炎症小体在缺血性脑损伤的病理过程中具有重要作用，NLRP3炎症小体激活后促进IL-1β及IL-18的释放以及调控细胞焦亡均能加剧梗死后缺血性损伤。除此之外，在临床研究中还发现患者血液中NLRP3炎症小体转录水平越高，急性脑梗死的预后越差，其原因可能是NLRP3炎症小体加剧脑梗死炎症级联反应以及对抗抗栓药物的治疗作用[41]。但是目前临床上NLRP3炎症小体的特异性抑制剂研究还较少，P2X7R、MAPK和Nrf2/ARE信号通路都是调节NLRP3炎症小体激活的潜在机制，可以为未来对脑梗死的防控及治疗提供了新的思路，而且还能为研发NLRP3炎症小体抑制剂提供新的方向，但是更具体的调控机制仍需更多的体内体外实验加以研究。