骨髓间充质干细胞在牵张成骨中迁移调控机制的研究进展

蔡杰钦 综述 魏波 审校

广东医科大学附属医院骨科中心，广东 湛江 524000

牵张成骨是骨再生技术的一种，其原理为将骨皮质切开，施加持续而稳定的骨牵张力于骨皮质断端，促进张力微环境下成骨系细胞的增殖，刺激新骨生成[1]。在研究中发现，牵张成骨过程中，除骨组织再生外，也同时存在肌肉、血管和神经等软组织的生成，可有效发挥自身再生机能[2]。然而AL-NAMNAM等[3]认为，牵张成骨应用过程中同样存在一系列弊端，如治疗时间长，出现针道感染、成骨不全、牵张器脱落和神经损伤等风险事件的发生率，长时间的佩戴牵引器也会影响患者的日常生活。分析其原因是临床工作者尚未完全地明确牵张成骨机制。然而，谢玉等[4]和卓丽丹等[5]在研究中发现，牵张成骨与骨髓间充质干细胞关系密切，正常生理状态下可在脊髓血管干细胞龛中发现骨髓间造血干细胞的存在。牵张应力为牵张成骨新骨形成创造条件，骨髓间充质干细胞在此基础上自干细胞龛迁移至骨形成处[6]。如此一来，对骨髓间充质干细胞在牵张应力下的迁移机制进行探讨，便可为把握牵张成骨机制和解决技术瓶颈打下良好基础。王琳等[7]开展的一项研究显示，应力微环境可激活促分裂素原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶1/2和哺乳动物雷帕霉素靶向基因，使后者对细胞增殖、分化和迁移等生物学反应进行调控。但上述分子通路对牵张成骨的作用尚未形成明确定论。本文对三种分子的表达及对应信号分子在牵张应力下在骨髓间充质干细胞迁移中的作用予以探讨，以加深对应力状态下骨髓间充质干细胞的了解程度，提高牵张成骨的临床应用价值。

1 牵张成骨临床应用

牵张成骨最先由意大利学者伊利扎洛夫提出，在股骨牵张术中取得了良好的效果，但术后并发症同样不容忽视[8]。受当时技术条件和医疗水平的影响。相关工作者对牵张成骨的研究只限于表面，使得牵张成骨在之后相当长的一段时间内未在临床中得到广泛应用[9]。二十世纪五十年代，有学者在开展了大量研究的前提下，提出“张力-拉力法则”，为牵张成骨提供了理论基础，也以此为前提形成了科学规范的使用原则和技术要求[10]。在二十世纪八十年代早期，该技术首先传入意大利，随后AO组织将其在世界范围内推广[11]。如今，随着临床工作者对该技术探讨的不断深入，牵张成骨技术已在骨外科、整形外科、颌面外科的疾病治疗中被广泛应用[12]。在通常情况下，牵张成骨的过程主要分三个阶段[13]：潜伏期、搬移期、固化期。潜伏期是截骨术后至搬移期开始前时期，一般为5～7 d。此时的生物活性与骨折愈合初期相似，主要表现为血肿形成，骨折断端的骨细胞、破损的骨膜和周围细胞发生坏死，并释放多种成骨因子。搬移期，利用外固定支架以恒定的速度持续稳定的牵张分离两截骨端，在外界持续稳定的机械牵张刺激下，搬移区的成骨性因子和成骨性细胞始终保持高水平和高活性状态，持续刺激搬移区的骨质再生[14]。

牵张成骨术可以在新生骨周围形成有效的血运。具有成骨效果的长期稳定性牵张成骨无需植骨、创伤小，周围软组织可同期扩张，主要用来治疗骨与软组织较大缺损、感染性骨不连、肢体不等长以及肢体畸形等[15]。

牵张成骨技术临床应用价值极高，发展前景光明，使得相关工作者加大了对该技术的研究力度。目前该技术存在治疗时间过长的不足，在给患者造成诸多不便的同时，还极大的提高了治疗周期中发生感染、关节挛缩、成骨不佳等风险[16]。为此，临床工作者开始探索缩短治疗时间，保证治疗效果的方式，成效明显。

2 动物模型建立和临床效能应用

在研究促进牵张成骨成骨质量的各种实验中，不同的动物模型对实验结果势必造成一定的不确定性，对从事牵张成骨技术相关研究难度较大[17]。有人开始将大鼠作为动物模型，在大鼠股骨骨折中成功运用牵张成骨技术，因大鼠饲养方便、试剂丰富，可为更为广泛而深入的研究提供方便，也为广大学者所接受，从而为该技术的研究提供了较好的平台[18-19]。

在牵张部位使用有助于细胞增殖、软组织修复和骨组织生成的生理活性制剂，促使新骨生成，软组织再生，发挥牵张成骨术作用的关键[20]。因此临床学者不断尝试用生长因子、富血小板血浆、甲状旁腺激素和缺氧诱导因子等生物制剂，以提高牵张成骨技术临床效能，均为相关动物实验所证实，成效明显。AGARWAL等[21]认为，生长因子类型多样，分为神经生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子，生物学功能广泛，既可自行分泌，也能经内分泌方式发挥作用，利于细胞生长、增殖、分化和迁移，为广大研究者所接受，应用前景广泛。柳玉晓等[22]学者在研究中发现，在牵张成骨动物模型中使用神经生长因子，可有效恢复神经功能；局部注射纤维细胞生长因子，有助于新骨骨量和密度的提升。富血小板血浆可对牵张区进行覆盖，降低术去暴露风险，可预见其对软组织的积极影响。

从当前阶段的发展形势看，生物制剂仍在动物实验阶段应用，临床研究有关的报道有限，主要是因为牵张部位中生物制剂停留时间有限，对周围组织和成骨组织作用有限，临床应用受限。这就需要临床探讨使用生物制剂提高牵张成骨作用效能的方式，同时对其他提高途径予以探讨。

牵张加力时，骨断端和截断区充满骨髓间充质干细胞血管内皮细胞和成骨细胞，在刺激新骨生成，构建结缔组织、恢复周围软组织等方面发挥着重要作用[23]。在此背景下，学者将益于神经、肌肉和成骨等组织功能恢复的基因导入成骨系细胞，可更好地发挥该技术新骨生成能力和促进软组织修复的作用，这也是牵张成骨术的重点研究方向[24]。张同威等[25]在兔下颌牵张区注入碱性成纤维细胞生长因子，结果显示牵张成骨的骨再生能力明显提升。一项研究将神经生长因子β导入间充质干细胞中，将其注入兔下颌骨牵张间隙，使得下槽牙神经功能得到明显恢复[26]。成骨系细胞是成骨研究中的重点，但现有技术水平低、免疫排斥和自体骨髓间充质干细胞获得难度大等因素的影响，使得成骨系细胞临床应用受限，需深入探讨，以促进技术水平的提升[27]。

组织工程技术在牵张成骨术中前景光明，通过制成各种材料来搭载生物制剂、成骨系细胞，为细胞增殖和分化提供微环境，以发挥牵张成骨术临床效能[28]。天然多聚物、无机材料、合成聚合物和纳米材料均属于现阶段常用的载体材料，在恢复神经功能、获取新生骨组织方面起着重要作用[29]。但将纳米材料作为载体材料尚处于初步阶段，需行广泛而深入的探讨。

3 牵张成骨机理研究进展

牵张成骨同时以骨再生和软组织生长为目标，形成足量新骨是其成功的关键。它包括软骨内成骨、膜内成骨和类软骨样成骨三种成骨方式，以膜内成骨为主，与骨折后新骨形成差别较大[30]。从组织学方面看，成骨是在张应力下大量合成与分泌胶原纤维，期间伴随邻近血管侵入、骨髓间充质干细胞迁移至新骨形成区，成软骨向分布，促使骨截断区生成新骨，使得骨小梁长大、合成并成熟，实现骨再生的目标[31-32]。牵张成骨分子机制尚未形成明确结论，但促炎性细胞因子、促血管生长因子和转化生长因子-β超家族成员在牵张加力过程中发挥着重要的调控作用[33]。白细胞介素-1和白细胞介素-6可对膜内成骨进程予以调控；促生长因子可刺激成骨系细胞的成骨向分化，利于骨组织再生。肿瘤坏死因子-α可对免疫反应和炎症反应予以调控，也可调控牵张成骨中骨重建。转化生长因子-β可对骨形成过程中成骨系细胞分化能力进行调控，血管内皮生长因子可促进血管形成，在骨牵张形成中作用明显[34]。由此可以看出，外部使用上述因子，可充分发挥牵张成骨临床效能。但其临床应用很少取得成功，主要是因为调控机制和成骨系细胞机制尚未明确。

应力在机体上的作用是以应力传导为基础，应力传导指的是外界应力微环境在细胞上发挥作用，使得细胞应力感受器被激活，引发生物化学反应，将外界应力信息转化为内部分子信号，引起细胞特定反应的生物学进程[35]。肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞等均可感受到力学刺激，并由之激活。如此一来，外力加载骨组织应力传导过程后，引起骨组织内微环境间质液流动，使得剪切应力产生，激活病传递内部信号至周围细胞。然而牵张力是施加在骨断端处，骨组织和周围软组织在此过程中同时生长，无法对应力传导过程作出准确解释[36]。

细胞应力感受器捕捉并向下传导细胞对外界的应力刺激，整合素、细胞骨架与黏着斑、浆膜结构、钙黏蛋白和其他细胞间连接均属于细胞中含有的应力感受器[37]。整合素可经跨膜结构，在细胞外基质上黏附细胞，促进胞质和细胞外环境的沟通；细胞骨架是细胞特有的信号感应与传导的感受器，黏着斑是连接细胞外基质和细胞骨架的桥梁，通过连接F-肌动蛋白，来向细胞内传递应力信号，激活信号分子级联酶促反应，二者可对外界应力刺激作出反应，进行信号传导。除此之外，跨膜蛋白、脂质和胞膜窖同样能感受到应力刺激，对细胞信号传导予以介导；钙黏蛋白是重要的细胞应力感受器，可对细胞信号传导进行介导，是β-连环蛋白传导入核的上游分子。需要注意的是，离子纤维毛、初级纤毛、缝隙连接同样在牵张应力信号传导中发挥着各自的作用。

外界应力刺激在细胞应力感受器的介导下，改变细胞内分子信号，其应力转导方式包括调控蛋白核向转运、蛋白酶级联反应、第二信使系统和F蛋白调节信号[38]。GTP激酶可与水解鸟嘌呤三磷酸特异性结合，对细胞代谢过程予以调控；张应力经G蛋白偶联受体激活GTP,促进细胞质内环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷和钙的上调。平滑肌细胞、成纤维细胞和骨髓间充质干细胞中的GTP激酶在牵张应力下被激活。蛋白激酶包括丝裂原激活蛋白激酶、黏着斑激酶和Src激酶，丝裂原激活蛋白激酶可对细胞分化、增殖、迁移和凋亡发挥调控作用，在信号介导与传递环节中，经级联激酶的酶促生化反应是通过依次激活MKKK、MKK和丝裂原激活蛋白激酶的方式实现的。黏着斑激酶在黏着斑周围聚集，可对生长因子进行调节，也能传递外界应力信号，与桩蛋白等多种信号分子存在联系，进而激活包括丝裂原激活蛋白激酶在内的许多信号通路。通常情况下，应力加载后骨细胞中钙离子改变最先被检测到，细胞胞质内钙离子在牵张应力下募集，钙离子表达的改变与IP3、NO和ATP等信号通路密切相关。细胞内钙离子募集可激活蛋白酶A、c-fos基因和丝裂原激活蛋白激酶等多种下游通路。前列腺素E3在应力成骨下的作用不容忽视，其激活以钙离子调控为基础。雌激素受体可以应力下成骨活动进行调控，去除雌激素受体的小鼠，对应力反应的灵敏性远不及野生小鼠；同样，加载应力后，雌激素受体被去除的小鼠，其转录调控低于野生小鼠。它是通过基因组和非基因组来对骨细胞牵张应力反应进行调控的[39]。

4 牵张成骨中骨髓充质间干细胞迁移研究

多向分化潜能是骨髓充质间干细胞重要特征之一，它指的是在条件满足的前提下，经诱导分化为骨、软骨和肌肉等不同组织细胞，它是组织工程和再生医学中的研究重点[40]。

生理条件下，骨髓充质间干细胞保持静息状态，为骨髓中间充质干细胞龛控制，而不是在组织中游离。一般来讲，间充质干细胞在组织器官特定微环境中存在，该环境可对间充质干细胞自我更新能力起到明显的维持作用，也可对该细胞大量分化予以防范。间充质干细胞龛以间充质干细胞、整合素、血管内皮细胞和细胞外基质为微环境的主要成分，多位于成骨细胞或是血管周围，骨髓充质间干细胞多依附血管存在，属于血管中细胞亚群。

创伤等病理条件和应力等外界刺激可使骨组织中的骨髓间充质干细胞处于动态，在外界刺激下，骨髓间充质干细胞自干细胞龛脱离，迁移至成骨前线，分化后形成成骨细胞，使得新生骨质沉积，对受损骨组织予以修复[41]。应力主要通过扰动、影响细胞外基质刚度和改变细胞刚性三种形式在干细胞龛中骨髓间充质干细胞上发挥作用，满足三种条件中的任何一项，便可导致骨髓间充质干细胞脱龛。由此可以看出，骨髓间充质干细胞生物学效能的发挥以细胞脱龛后迁移至成骨部位为前提牵张应力下的牵张成骨过程同样如此。

牵张成骨需要实现骨质降解和新骨再生的动态平衡。基质金属蛋白酶可对骨细胞外基质发挥降解作用，在牵张成骨中起着重要作用。此外，细胞迁移同样少不了基质金属蛋白酶，主要是因为该过程中存在细胞外基质降解，基质金属蛋白酶可调控牵张应力下间充质干细胞的生物学行为[42]。

YANG等[43]在临床研究中发现，骨髓间充质干细胞存在血管周围的干细胞龛，血管周围为血管基底膜环绕，为骨髓间充质干细胞维持在血管周围创造了一个合适的微环境。血管基底膜以明胶、ⅣX型胶原和层黏连大蛋白为主要成分。基质金属蛋白酶2可对血管基底膜起到降解作用，促进骨髓间充质干细胞脱龛与迁移。

5 小结

综上所述，尽管自有研究提出牵张成骨的“张力拉力法则”及相关应用原则以来，牵张成骨技术在临床上应用提升明显。然而，牵张成骨治疗周期长，可能出现成骨不全等一系列不足如今已极大限制了其进一步的提高。正因如此，研究该技术相关分子机制尤其是骨髓间充质干细胞在牵张成骨中迁移调控机制，在突破其临床应用发挥着重要作用。相信随着医疗技术水平的不断发展和相关工作者对牵张成骨技术研究的不断深入，将完全揭示牵张成骨中干细胞迁移与调控机制，并在此基础上促进牵张成骨临床效能的提升。