原花青素的研究进展

刘玟君，李金洲，陈子隽，黄周艳，陈 勇

（1.广西中医药科学实验中心，南宁 530200；2.深圳市中西医结合医院，广东 深圳 518027；3.桂林市人民医院，广西 桂林 541002）

原花青素（Procyanidins，PC）是一类由不同数量的儿茶素或表儿茶素通过C-C键缩合而形成的聚合物，又称为缩合单宁［1］。根据原花青素聚合度的不同，又可分为单体、低聚和高聚原花青素，其中以二聚体分布最广［2，3］。原花青素广泛存在于多种植物的果、叶、子、皮中，其中葡萄子中原花青素的含量高达95%［4］。原花青素具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞、抗癌、降血压、降血脂、降血糖等药理活性［5］。研究发现，原花青素的活性与其化学结构有关，聚合度较低的原花青素抗氧化性活性较强［6，7］。本研究主要对近五年有关原花青素的提取方法、含量测定方法、分离纯化以及药理活性等方面进行整理归纳，以期为原花青素的研究提供指导。

1 原花青素的提取方法

提取是分离、鉴定和利用原花青素的重要步骤。查阅文献发现，目前对于原花青素的提取方法主要有：溶剂提取法、酶提取法、超临界CO2提取法、超声波、微波辅助提取法等。

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是根据相似相溶的原理，选取对目标成分溶解度大，而对非目标成分的溶解度小的溶剂，从而将目标成分从原料中提取出来的一种方法。原花青素可溶于水和绝大多数有机溶剂，常用的提取溶剂有水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮等［8］。有研究发现，采用混合溶剂与采用单一溶剂（甲醇、乙醇）对葡萄子中原花青素进行提取，发现混合溶剂的提取率分别提高了13.38%和9.20%［9］。溶剂提取法虽然操作容易，对设备要求较低，但提取时间较长，提取率较低，且所用的有机溶剂很有可能会残留在目标成分中。

1.2 酶提取法

酶提取法是一种优良的提取方法，有学者利用双酶法破坏植物细胞壁，促进细胞内的原花青素的快速溶出，再利用溶剂回流使原花青素成分有效提取出来，酶法提取能在一定程度上提高提取率，在生物活性物质提取方面已被广泛利用［10，11］。常用的酶有纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，其中pH、酶解时间、温度等因素都会影响酶活性，所以必须严格控制反应参数，且酶可能会造成中药某些成分的变性分解，导致产物的纯度降低［12，13］。

1.3 超临界CO2提取法

CO2是最常用的超临界流体，原花青素中含有多羟基基团，而CO2属于非极性溶剂，因此在提取原花青素过程中需加入一些极性夹带剂，如水、乙醇、甲醇以及二氯甲烷等［14］。颜雪琴等［15］以乙醇为夹带剂对石榴皮中的原花青素进行提取，在乙醇体积分数65%、料液比1.0∶1.3、CO2流速5 L/h、提取温度48℃、提取压力35 MPa条件下，试验所得到原花青素的提取率可达3.40%。

1.4 辅助提取方法

1.4.1 超声波辅助提取 超声波可以加速对植物细胞壁的破坏，使细胞内的物质加速溶出，从而提高提取率。目前，国内外对原花青素的提取工艺较多，发现其研究集中在采用超声波协同酶法、溶液提取法、机械研磨法等方面。有学者采用超声波-乙醇法对山楂中原花青素进行了提取工艺研究，发现采用该方法时，山楂中原花青素的提取率可达1.781%［16］。有研究采用超声-微波协同法对酒花残渣中的原花青素进行提取，发现原花青素的提取率显著高于超声波提取法或微波提取法［17］。吕品等［18］首次将超声波与酶解技术结合，对莽吉柿果壳中的原花青素进行提取，通过单因素及响应面试验对工艺参数进行优化，其提取最佳工艺条件为纤维素酶用量2%、酶解时间68 min、酶解温度58.5℃、超声功率320 W、超声时间20 min，结果发现，原花青素的提取率高于单独使用超声波和酶法提取。超声波-机械研磨法是指在超声波的基础上，增加物理性外力，利用机械摩擦产生相应机械剪切力来破坏植物的组织结构，从而增加有效成分的溶出。程海涛等［19］利用超声波-机械研磨协同法提取彩椒中原花青素，通过单因素试验和响应面试验优化提取工艺，最终原花青素的提取率可达6.211 mg/g。

1.4.2 微波辅助提取 在微波场中，不同物质吸收微波的能力不同，使得不同的物质被选择性加热，加速目标成分的溶出。微波辅助提取能显著缩短提取时间，增加提取率。张兵兵等［20］采用微波-酶法对葡萄子中的原花青素进行提取，并且经过AB-8型大孔树脂纯化后，得到的原花青素纯度为95.6%。容晨曦等［21］采用微波辅助法提取刺玫子中的原花青素，不仅显著提高了原花青素的提取率，且缩短了提取时间和加热时间。

2 原花青素的分离纯化

植物中的化学成分复杂多样，需要经过反复的分离、纯化等过程才能提高目标成分的纯度。目前，对于原花青素类化合物的纯化，应用最多的方法有膜结合柱层析法、大孔树脂柱层析法、聚酰胺柱层析法、高速逆流色谱法等。

2.1 柱层析法

柱层析法又称柱色谱法，是利用吸附剂对样品中各组分吸附能力的不同，从而达到分离的一种方法，其中最常用有的吸附剂有硅胶、大孔树脂、聚酰胺等［22］。梁敏等［23］选择5种大孔吸附树脂对葡萄子原花青素进行纯化，结果表明HPD400更适合葡萄子原花青素的分离与富集，纯化后的原花青素含量可高达85%。聚酰胺中含有丰富的酰胺基团，酰胺基团可与化合物中的酚羟基形成氢键，由于形成氢键的数目、强度不同，聚酰胺对不同化合物的吸附能力也不同，利用不同梯度的甲醇或乙醇溶液进行洗脱，溶剂分子可与酰胺基团形成氢键，将化合物分子替换出来，从而达到分离的目的。聚酰胺柱层析主要用于黄酮类、多酚类化合物的分离纯化。原花青素是一类以儿茶素或表儿茶素为结构单元的缩合多酚类化合物，分子上有丰富的酚羟基，可与酰胺基团形成氢键，因此，可以用聚酰胺对原花青素进行分离纯化。吕丽爽等［24］通过聚酰胺柱层析法对葡萄子中的物质进行分离纯化，得到纯度较高且抗氧化性能优良的低聚花青素，纯度可达到99%。纪秀凤［25］先利用大孔树脂对红树莓子中的原花青素进行初步分离纯化，得到纯度较低的原花青素初纯物，再经聚酰胺二次纯化，得到高纯度低聚原花青素。

2.2 膜分离法

膜分离法是指采用具有选择透过性的薄膜作为分离介质，在浓度差、压力差或电位差的作用下使混合物中的组分选择性地透过膜，从而达到分离的目的。利用膜分离法可以除去混合物中的大分子物质及胶体物质，如蛋白质、多糖、鞣质等。可采用膜分离技术，根据聚合度不同将原花青素进行分离。陈文良等［26］采用此法从葡萄子中分离低聚原花青素，所得含量高达65%。张娣等［27］研究发现，采用PAN膜-大孔树脂联用分离纯化莲房原花青素，得到的原花青素纯度在81%以上，高于直接进行大孔树脂分离的63%。

2.3 高速逆流色谱

高速逆流色谱（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）结合了液-液萃取和分配色谱的特点，是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。王尉等［28］采用高速逆流色谱结合制备液相色谱法从葡萄子乙醇提取物中分离得到了8种多酚，其中原花青素B1、原花青素B2、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯和儿茶素的纯度分别为98.5%、97.2%、98.3%、98.9%和96.7%。Zhang等［29］采用高速逆流色谱法，根据聚合度不同，有效地从葡萄子中分离出7个不同馏分的原花青素，其分离纯度可高达95.7%。

3 原花青素的含量测定方法

通过查阅文献发现，目前原花青素的含量测定方法主要有盐酸-正丁醇法、香草醛法、DMAC法、高效液相色谱法。

3.1 盐酸-正丁醇法

盐酸-正丁醇法又叫铁盐催化法，是根据原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素，其显色原理为在正丁醇的盐酸溶液中，Fe3+为催化剂，在加热的条件下，原花青素结构单元之间的C-C键断裂，末端单元以黄烷-3-醇形式解离，延伸单元生成碳正离子并继续失去质子生成黄烷-3烯-3醇，并被继续氧化成在550 nm处有紫外吸收的花青素。该法具有专属性，儿茶素、表儿茶素等结构单体在该条件下不显色，可排除该类物质对显色的干扰［30，31］。

3.2 香草醛法

香草醛法是目前使用最为广泛的测定方法，其反应原理为在强酸作用下香草醛能与原花青素类物质A环上的间苯二酚或间苯三酚发生缩合反应，在浓酸作用下（盐酸或硫酸）生成在500 nm处有紫外吸收的有色的正碳离子，吸光度与浓度在一定范围内呈线性相关关系［32］。但是，该法不具专属性，很多黄酮类化合物A环上也具有间苯二酚或间苯三酚结构，原花青素一般是多聚体，1个分子中有多个活泼的A环与香草醛结合，因此，以儿茶素为对照品采用该法所测得的结果高于实际值。

3.3 DMAC法

对-二甲基氨基肉桂醛（DMAC）法，其反应机理为DMAC在酸性条件下与黄烷醇发生脱水缩合，生成在640 nm处有紫外吸收的蓝色产物，其颜色与浓度呈正比［33］。黄雪松等［34］以DMAC为显色剂测定了山竹果皮、花萼和果肉中原花青素含量。该方法灵敏度比香草醛法高、速度快且专属性强［35］。

3.4 高效液相色谱法

利用HPLC法测定反应后产物的含量，即可测定原花青素的含量［36］。黄文烨等［37］采用硫解衍生法和RP-HPLC法对山竹壳中可提原花青素（EP）和不可提原花青素（NEP）进行了测定，准确测出竹壳中原青素的组成单元、含量和平均聚合度。张璐等［38］通过RP-HPLC法同时测定原花青素中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2的含量，结果表明该方法具有简便、准确、重复性好的特点。

4 原花青素药理活性

4.1 清除自由基及抗氧化活性

原花青素类物质是一种以儿茶素或表儿茶素为主要结构单元的多酚类聚合物，是一种天然的抗氧化剂，具有较强的抗氧化活性。据文献记载，原花青素体内的抗氧化能力是维生素C的20倍、维生素E的50倍［39］。因为具有优异的抗氧化性能，被广泛应用于医药卫生、保健品、化妆品等领域［40］。有研究发现，在体外抗氧化试验中，山楂原花青素在一定剂量范围内对羟基自由基、DPPH自由基的清除率及总抗氧化能力显著高于维生素C，且抗氧化能力与浓度呈正相关［41］。研究发现，人体内产生过量的自由基是导致机体肝脏损伤、衰老及其他疾病产生的原因之一，葡萄子原花青素（GSPE）能够通过提高机体内的抗氧化能力，抑制氧化应激作用来缓解糖尿病小鼠基本情况，缓解肾脏损害［42］。张勍等［43］研究发现，夏黑葡萄花青素可通过调节衰老小鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的活性，清除衰老小鼠心肌细胞中的自由基，保护衰老小鼠的心肌细胞。

4.2 抗炎

炎症本身是机体对外源刺激的一种防御或免疫反应，但过度或持续性炎症反应会引发多种炎症相关性疾病。全帅等［44］研究发现，葡萄子低聚原花青素可以降低结肠组织中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平，上调Nrf2和HO-1蛋白的表达水平，上调结肠组织中SOD水平，下调MDA水平，从而改善小鼠溃疡性结肠炎。有研究发现，原花青素对内毒素血症小鼠具有保护作用，其作用机制可能与抑制NO、IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达有关［45］。王青等［46］研究发现，原花青素B1和B2均能抑制LPS诱导的BV-2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放，并能抑制NF-κB的磷酸化，且两者作用强度无显著差异。赵雅宁等［47］研究发现，葡萄子原花青素可减轻慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应，改善大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与抑制大鼠脑组织内p38MAPK的活性和炎症因子IL-1β的表达有关。

4.3 降血糖、降血脂

刘奇等［48］通过采用不同体积分数乙醇渗漉提取，经大孔树脂层析，得到不同乙醇梯度葡萄子原花青素洗脱物，并采用高血脂大鼠模型对乙醇梯度洗脱物进行降血脂药效部位筛选，发现50%乙醇洗脱物能明显降低高血脂大鼠的谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的含量，各乙醇梯度葡萄子原花青素洗脱物均可以促进甘油三酯的代谢，提高肝脏代谢功能，抑制体内脂质的大量沉积，抑制动脉粥样硬化的发展，进而起到降血脂作用。胡济美等［49］通过高脂模型小鼠试验，对刺玫子原花青素进行降血脂研究，发现刺玫子原花青素高剂量组（200 mg/kg）可以显著降低高脂小鼠血清内低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、甘油三酯含量，调节小鼠血脂代谢来达到降血脂的作用。刘灵等［50］研究发现，葡萄子原花青素能缓解血清胰岛素抵抗水平、修复损伤的β细胞、调节β细胞的增殖和凋亡等方面来调节糖脂代谢，对2型糖尿病患者有明显的降血糖、降血脂作用，且不会对肝肾及造血功能造成不良影响。此外，还有研究发现，原花青素还可以通过提高机体抗氧化能力、降低炎症因子对胰岛细胞的损伤，调节血清的甘油三脂、总胆固醇和高密度脂蛋白达到降血糖和改善血脂的作用，如龙眼核原花青素［51］、昆山雪菊原花青素［52］、葡萄子原花青素［53］、松树皮原花青素［54］。

4.4 抗癌、抗肿瘤

原花青素对癌症、肿瘤具有一定的预防和治疗作用，其作用机制主要有抑制细胞生长，诱导肿瘤细胞死亡，调控分子信号通路NF-κB、MAPK、PI3K/AKT中的蛋白质［55］。郭方明等［56］研究发现，葡萄子中的提取物原花青素可以诱导人食管癌细胞凋亡，其作用机制与抑制NF-κB通路中相关蛋白、活化Bax从而抑制PGE2、CRP的产生有关。研究发现，原花青素B2可以通过下调PI3K/Akt通路中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达诱导直肠癌细胞凋亡和自噬［57］。红小豆中含有的原花青素，主要是儿茶素聚合物类组分对人体PC-3前列腺癌细胞具有显著的抗癌活性，且他们还能通过抑制脂肪酸结合蛋白5基因的表达来控制前列腺癌细胞生长和转移［58］。

5 小结与展望

现代研究发现，在健康状态下，自由基是神经传导和炎症反应必不可少的重要介质，能够增强机体的免疫力等作用。但是在病理状态或外界环境的刺激下，多余的自由基会破坏人体细胞，造成机体的一系列损伤。据文献记载，与自由基有关的疾病多达70余种［59］。虽然在健康状态下，人体能通过超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、维生素C、维生素E等物质清除体内多余的氧自由基，维持体内氧自由基的平衡。但是随着年龄的增长，体内这些物质就会相应减少。需要适当补充维生素C等抗氧化物质来维持机体氧自由基的平衡［60］。但是长期服用维生素C可能会对人体健康产生潜在的危害，因此，需要不断发掘不同的天然抗氧化物质，开发各种类型抗氧化效果较好的产品。

当归藤是广西少数民族民间常用药物，具有补血调经、活血止血、祛风止痛、舒经活络等功效［61，62］。当归藤中含有丰富的儿茶素、原花青素类成分，且含量较高。但是目前对于当归藤原花青素的研究较少，由于当归藤中原花青素的抗氧化能力强，极易在空气中被氧化，给分离提取带来较大的困难。可通过文献调研，为当归藤提取分离纯化、抗氧化研究，补血活血相关研究提供研究思路和方法。