番石榴叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究

李丙添，宋凤兰，刘锐锋，廖础欣，赵伟国

(1.中山市人民医院药学部，广东 中山 528403；2.广东药科大学中山校区，广东 中山 528400)

对于桃金娘科番石榴树植物中的番石榴，其干燥叶以及带叶嫩枝就是番石榴叶，在我们华南地区多有种植，资源丰富[1]。在中医领域中，认为番石榴味涩以及性平，具有清热解毒、燥湿健脾的功效。而通过现代医学的实验发现，番石榴的抗病毒、抗疟、止泻、降血糖血脂等药理作业非常显著[2-4]。番石榴叶中的黄酮、酚类、多糖、皂苷、挥发油等功能成分含量较大，特别是黄酮类化合物和其抗菌消炎、降血糖、降血脂、抗病毒等方面有着直接关系，具有很高的研究价值[5-6]。本课题采用超声法提取番石榴叶中的总黄酮，采用正交实验方式对番石榴叶总黄酮的提取工艺展开优化，并对提得总黄酮的抗氧化活性进行考察，为其后续深入开发以及应用提供理论保障。

1 材料与试剂

红心番石榴叶采自广东省湛江市，经鉴定为桃金娘科番石榴属番石榴叶；采用天津市大茂化学试剂厂的三氨基甲烷、焦性没食子酸、硝酸铝；采用上海伊卡生物技术有限公司的DPPH、ABTS；采用天津市永大化学试剂有限公司的硫酸亚铁、水杨酸、30%双氧水、过硫酸钾、盐酸；其他实际都选择分析纯。

选择昆山市超声仪器有限公司的KQ-100VDE三频数控超声波清洗器；选择上海美谱达仪器有限公司的V-1100型可见分光光度计；选择温岭市林大机械有限公司的摇摆式高速万能粉碎机；选择上海博迅实业有限公司GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱。

2 方法与结果

2.1 番石榴叶总黄酮的含量测定

参考有关文献，采用Al(NO3)3直接显色法测定番石榴叶总黄酮含量[7]。移取芦丁标准溶液或待测样品液1mL于25mL容量瓶中，添加1mL的10%Al(NO3)3溶液，混匀，之后静止放置6分钟，采用70%乙醇进行定容处理，保证满足刻度要求，之后摇匀并静止放置10分钟，在413纳米位置开展吸光度的测试工作。芦丁标准溶液在0.0128～0.0896mg/mL的范围内，吸光度与浓度的线性方程为Y=19.852X+0.1224，r=0.9996，线性关系良好。

2.2 改进番石榴叶的总黄酮提取工艺

番石榴叶40℃干燥至恒重，粉碎过40目筛，得番石榴叶粉末备用。经预实验筛选，选择超声法提取番石榴叶中总黄酮。称取0.500g番石榴叶粉末，置具塞三角瓶中，加入一定比例的70%乙醇，称重，浸润5min，于50℃、功率100w、频率80Hz的条件下，采用超声方式开展提取工作，时间为30分钟，冷却，溶剂补足重量，过滤，得总黄酮提取液。

2.2.1提取工艺单因素考察

(1)总黄酮提取效果受到乙醇浓度的影响情况

称取0.500g番石榴叶粉末6份，并添加到10mL的40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇(料液比1∶20)中，于50℃条件下，采用超声方式开展提取工作，时间为30分钟，通过提取液进行总黄酮含量计算，并对该工艺提取率进行计算。由结果可见，番石榴叶中的总黄酮提取效果会受到乙醇浓度影响，若是乙醇的浓度低于80%，则总黄酮提取率和乙醇浓度之间属于正比关系。若是乙醇的浓度超出80%，则黄铜提取效率并不会随之增加，还会出现一定下降。故番石榴叶总黄酮超声提取，应该尽量选择80%左右的乙醇。

(2)总黄酮提取效果受到料液比的影响情况

称取0.500g番石榴叶粉末6份，分别按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入70%的乙醇，于50℃条件下，采用超声方式开展提取工作，时间为30分钟，通过提取液进行总黄酮含量计算，并对该工艺提取率进行计算。由结果可见，提取溶剂用量越大，黄酮提取率越高，降低料液比有利于黄酮类物质的溶解与扩散，提取效果更佳。但也可以看出，当料液比小于1∶20时，番石榴总黄酮提取率增幅变缓。综合考虑生产成本，料液比选择1∶25左右较佳。

(3)总黄酮提取效果受到温度的影响情况

称取0.500g番石榴叶粉末5份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，采用超声方式开展提取工作，时间为30分钟，通过提取液进行总黄酮含量计算，并对该工艺提取率进行计算。通过计算结果能够发现，温度并不会对航通提取效率产生较大影响。这可能是因为超声提取温度是通过外部水浴温度调控的。虽外部水浴控制一定温度，但溶剂内部会局部升温，溶剂温度短时间难以与外部水浴一致，不同提取温度下，溶剂内部温度相差并不大。40℃～60℃时提取率随温度增加而增大，温度超过60℃，提取率反而下降。故提取温度选择60℃左右较佳。

(4)总黄酮提取效果受到时间的影响情况

称取0.500g番石榴叶粉末6份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，于50℃分别超声20min、25min、30min、35min、40min、45min，提取液测定总黄酮含量，计算总黄酮提取率。由结果可见，超声提取时间小于40min时，在时间不短延长过程中，黄酮提取效率不断增加，但提取时间超过40min，提取率反而有所下降。因此，提取时间选择40min左右较佳，见图1。

图1 番石榴叶总黄酮提取率受到乙醇浓度、料液比、温度、时间的影响情况

2.2.2正交实验优化提取工艺

结合单因素的实验情况，采用温度、时间、料液比以及乙醇4个因素设计正交实验，优化总黄酮提取工艺，详见表1、表2、表3。

表1 正交实验中相关因素以及水平情况

表2 番石榴叶总黄酮正交实验设计与结果

表3 方差分析表

由正交实验结果(表2，表3)可知，上述因素中，乙醇浓度对于黄酮提取效率影响最为严重，料液比次之，温度对于黄酮提取效率影响最小，并且料液比和乙醇浓度对于黄酮提取的影响远远高于温度和时间的影响，有显著性差异。A2B3C1D2是番石榴叶总黄酮的最佳提取工艺。即乙醇浓度为80%，料液比为1∶30，提取温度为55℃，提取时间为40min。按照该工艺技术进行总黄酮提取，重复3次，平均提取率为(4.668±0.18)%，表明该工艺具有良好稳定性，并且提取率充分满足预期要求。

2.3 番石榴叶总黄酮体外抗氧化活性研究

以上述番石榴叶中的总黄酮最佳提取工艺为基础，参考有关文献[8-9]并结合预实验考察配制成适宜浓度的待测溶液对其DPPH、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除性能展开研究。

(1)清除DPPH自由基的实验

加显色剂的样品溶液：取待测溶液5mL，加1mmol/L DPPH溶液5mL，摇匀，基于室温避光条件，反应30分钟，517纳米处测其吸光度记为A1。不加显色剂的对照溶液：取待测溶液5mL，加5mL无水乙醇并摇匀，基于室温避光条件，进行静止放置处理，时间为30分钟，测其吸光度记为A2。空白溶液：取DPPH溶液5mL，加5mL无水乙醇，摇匀，室温避光静置30min，测其吸光度记为A0。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

番石榴叶总黄酮清除DPPH自由基的性能情况如图2，总黄酮对DPPH自由基具有显著清除作用，其清除能力在0.0216～0.1296mg/mL的浓度范围内随样品的浓度增加而增加，最高清除率可达62.78%。

图2 番石榴叶总黄酮清除DPPH自由基的性能情况

(2)清除超氧阴离子自由基(O2-·)的实验

加显色剂的样品溶液：取待测溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl缓冲溶液4mL，邻苯三酚盐酸液0.5mL，混匀后静置4min加浓HCl两滴停止反应，325nm处测其吸光度记为A1。不加显色剂的对照溶液：取待测溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl缓冲溶液4mL，10mmol/L的盐酸0.5mL混匀，静置4min加浓HCl两滴停止反应，测其吸光度记为A2。空白溶液：取70%乙醇1mL，0.05mmol/LTris-HCl缓冲溶液4mL，邻苯三酚盐酸液0.5mL，混匀后静置4min加浓HCl两滴停止反应，测其吸光度记为A0。

超氧阴离子自由基(O2-·)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

由图3可见番石榴叶总黄酮对超氧自由基(O2-·)虽清除率不高，但仍有一定程度的清除作用，其清除能力在0.0306～0.0714mg/mL的浓度范围内与样品的浓度有正相关的量效关系。

图3 番石榴叶总黄酮清除超氧阴离子自由基性能情况

(3)对羟自由基(·OH)的清除实验

加显色剂的样品溶液：取待测溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水杨酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，纯化水定容至10mL，避光静止放置30分钟，510纳米处进行吸光度定并记为A1。不加显色剂的对照溶液：取待测溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水杨酸-乙醇液0.5mL，纯化水定容至10mL，避光静止放置30分钟，测其吸光度记为A2。空白溶液：取70%乙醇0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水杨酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，纯化水定容至10mL，避光静止放置30分钟，测其吸光度记为A0。

羟自由基(·OH)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

图4 番石榴叶总黄酮对羟自由基的清除作用

结果可见，番石榴叶总黄酮可以充分清除Fenton体系产生的羟自由基，并呈现一定的量效关系。在0.216～1.512mg/mL的浓度范围内，在黄酮浓度不断增大过程中，其清除羟自由基的效果更加显著，清除率可达92.35%。

(4)对ABTS+自由基的清除实验

加显色剂的样品溶液：取待测溶液1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，静置30min，于734nm处测其吸光度记为A1。不加显色剂的对照溶液：取待测溶液1mL，加纯水4mL，静置30min，测其吸光度记为A2。空白溶液：取70%乙醇1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，静置30min，测其吸光度记为A0。

ABTS+自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

图5 番石榴叶总黄酮对ABTS+自由基的清除作用

结果可见，番石榴叶总黄酮对ABTS+自由基具有较为显著清除作用，在0.015～0.090mg/mL的浓度范围内清除率与浓度几乎成正相关，在0.126mg/mL的浓度时，清除率更是高达99.81%。

3 讨论

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系统显色是黄酮含量测定的常用方法[10]，但对番石榴叶总黄酮显色时，发现NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色处理会有棕褐色沉淀，可能是提取液中其它成分干扰所致，故本实验选择Al(NO3)3直接显色对番石榴叶总黄酮含量展开测定，方法学验证该含测方法稳定可行。

选择番石榴叶总黄酮具体提取方法时，曾考察了回流法、温浸法、超声法、微波提取等，结果发现超声提取提取率较高，且操作简单易行，本课题选择了超声法来提取番石榴叶总黄酮。通过采用正交优化以及发因素考察的方式对提取工艺展开改进，最终得到80%溢出，料液比1∶30，提取温度55℃，提取时间40min是总黄酮最佳提取工作，总黄酮提取率可达4.7%左右。

体外抗氧化研究表明，番石榴叶总黄酮对DPPH、·OH、O2-及ABTS+均有一定的清除效果，并且在一定范围内作用效果与浓度有量效关系，当清除率达到饱和时则不再随着浓度的增加而增加。但是其对各自由基的清除强度不同，仅从最大清除率比较而言，番石榴叶总黄酮抗氧化性由强到弱依次为ABTS+>·OH>DPPH·>O2-·。