对VRBA大肠菌群平板计数法的试验改进及研究

郭军明，孙焕芝，侯秀珍，张 英

（洛川县农产品质量安全检验检测中心，陕西 洛川 727400）

近年来，随着我国各项社会事业的不断发展进步和人民生活水平的不断提高，微生物检测工作也在食品安全、人畜饮用水安全、医药疾控、环境监测等各个领域内全面深入开展。其中，大肠菌落是环境中广泛存在的一种微生物，也是很多领域内国家规定的必检项目。比如饮用水的出厂检验必检项目有菌落总数、大肠菌落、铜绿假单胞菌等，其中就包括了大肠菌落。那么，如何提高检测效率，快速准确地完成大肠菌落检测操作就成了必须面对的问题。《GB 4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法大肠菌群平板计数法A.3.2中规定，结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）的制法是：将蛋白胨7.0 g、酵母膏3.0 g、乳糖10.0 g、氯化钠5.0 g、胆盐或3号胆盐1.5 g、中性红0.03 g、结晶紫0.002 g、琼脂15～18 g，溶于1000mL蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌,调节pH至7.4±0.1，煮沸2 min，将培养基融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。

实际操作中，一般选购现成的配方药品，常见的有北京陆桥和青岛日水等品牌。这些品牌的产品只需按照说明称取并溶解于相应剂量的水加热煮沸即可，与国标中的规定一致，只在说明中增加了“勿需高压灭菌”，只是指出勿需，没有否定高压湿法灭菌的可行性。

在实践操作时发现，加热煮沸环节中，如果用酒精灯加热，则需要不断搅拌，并且要注意用玻璃棒抠起黏在容器底部的药品，否则黏附的药品会被烧糊，不但影响平板的透明度和后续培养的效果，而且不易从容器底部洗刷清除，操作起来费时（酒精灯加热煮沸250mL药品需要40 min以上）费力，影响其他检验环节的相关工作；如果使用电热板加热，也存在同样问题，换用水浴锅加热，则无法达到煮沸药品所需温度，因此，后2种加热方式亦不可取。

为了方便操作，提高操作效率，文章进行了用灭菌锅高压湿热灭菌煮沸结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）的相关研究。这样做使药品煮沸可与培养皿等其他器具的灭菌同时进行，无需单独处理。

首先，从理论上看，VRBA中各成分的作用分别是：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素；结晶紫和胆盐都是抑菌剂，主要抑制革兰阳性杆菌和粪链球菌，避免其他杂菌对目标菌种培养的干扰；氯化钠可维持均衡的渗透压；琼脂加热后变为液态，冷却后就变成固体，作用是使培养基固化定型，为细菌提供一个融合了各种检测成分的生长环境；中性红是酸碱指示剂，大肠菌群能在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。

从其他国标试剂配方和灭菌要求上看，麦康凯琼脂（含蛋白胨、乳糖、氯化钠、胆盐、中性红、结晶紫、琼脂）可以加热溶解于1000mL蒸馏水中分装，121℃高压灭菌15 min备用（见GB/T4789.28-2003中4.24和GB/T4789.5-2003），此配方大多成分与VRBA相同，只是不含酵母膏。而用于菌落总数测定的PCA平板计数琼脂配方中含有酵母膏，也可以于121℃高压灭菌15 min（见GB4789中A.2）。理论上对VRBA进行高压灭菌是可行的，同时培养皿等其他试验器具也需要进行高压灭菌，一同进行，从而达到简化程序、省时提效的目的。

其次，要验证的是对VRBA在121℃条件下高压灭菌15 min的可行性。通过多次试验结果发现，直接把装有VRBA的敞口容器放入灭菌锅灭菌时，该培养液会大量溢出容器。这是因为，高压灭菌过程中培养液出现了暴沸现象，或者在灭菌完成后快速放气导致盛装容器内外压强差过大的结果。为此，研究人员进行了针对性的改进，具体做法是：每一批次待检样品按照国标要求随机抽取5个样品，各做2个连续稀释度，加2个空白对照，共计12个计数平板约需250mL预灭菌药品，放入灭菌锅时，把盛装于250mL锥形瓶中，瓶口倒扣一个250mL烧杯，烧杯上面再放置几个培养皿放入进行灭菌。这样可以使盛装容器内形成一个相对封闭的环境，有效防止了暴沸现象的发生。同时，灭菌完成后的放气要慢放，防止容器内外压强差过大而顶起烧杯发生药品外溢和仪器损伤现象的发生。改进后，灭菌环节实现了无溢损无黏底烧糊等现象，效果相当理想。

在经高压灭菌后，还有一个向培养皿中倾注VRBA平板的问题。高压灭菌过程中由于缺乏搅拌，只靠液体沸腾来混匀，其均一性是不够的，同时，冷却过程中，冷凝水回流到锥形瓶中，造成水液分离现象，倾注的平板往往会出现与培养皿不能很好附着，倒置时易掉落，平板多水发稀易碎裂难成型等问题，这种情况下试验无法继续。经过原因分析，找到了有效的解决方案。即灭菌完成后，待盛装容器不容易烫手时，用锥形瓶和盖口烧杯将药品来回多倒几次（在酒精灯火焰无菌区范围内）就可以了。这样做有2个好处，一是可以使VRBA热溶液的均一性得到很好的保证，不会出现稀浓不一的现象；二是保证了平板在培养皿内很好的附着性。

最后，高压灭菌的VRBA在对大肠菌群平板计数上的影响呢是整个操作过程中最核心的问题。研究人员用酒精灯加热煮沸法和高压湿法灭菌法分别处理VRBA，对饮用纯净水、生活污水等未知大肠杆菌含量样品先后进行了十多次的对比试验，从计数结果上看，两种方法对大肠菌落检出量和未检出量的培养计数结果基本吻合。

以上就是VRBA平板计数法改进的具体方法步骤和试验效果，希望能与大家相互交流，共同学习。