PD-1/PD-L1在自身免疫性疾病中作用的研究进展*

何红霞，范 恒，杨 佳

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022

程序性死亡受体-1(programmed cell death receptor 1，PD-1)是属于CD28/CTLA-4家族的一种分子量为50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是一种介导负性协同刺激信号的受体，由IgV型胞外域组成，与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、CD28和诱导型共刺激分子(ICOS)具有21%～33%的序列同一性。与形成同型二聚体的CTLA-4不同，PD-1缺少同型二聚体化所需的半胱氨酸残基，并且以单体形式存在于细胞表面以及溶液中。PD-1还缺乏在所有CD28、CTLA-4和ICOS受体中都存在的富含脯氨酸的配体结合基序。这些基本的结构差异表明配体识别方式和信号传导机制的差异[1]。PD-1在活化T细胞、B细胞、髓样细胞、胸腺细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞，以及从双阴性向双阳性阶段过渡的CD4-CD8-胸腺细胞上表达。与其他CD28家族成员在T细胞上的限制性表达相比，PD-1的表达范围更广，这表明PD-1调节的免疫反应范围更广[2]。

PD-1具有两个已识别的配体，程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)，也称为B7-H1或CD274，以及程序性死亡配体2(PD-L2)，也称为B7-DC或CD273。它们都是由IgC型和IgV型胞外域组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-L1和PD-L2与CD28和CTLA-4的配体B7-1和B7-2的氨基酸同源性约为20%。在PD-L1和PD-L2之间的氨基酸同源性约为40%。PD-L2配体仅表达于活化的单核细胞和树突状细胞，而PD-L1广泛表达于机体各组织[3]。PD-L1可以在造血谱系的细胞上表达，包括活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)和巨噬细胞。它还在外周非造血组织上广泛表达，在心脏、骨骼肌、胎盘、肺、肾和肝中检测到中等至高表达。据报道，PD-1和PD-L1除了膜结合形式外，还具有可溶形式[4]。可溶形式增加了PD-1/PD-L1途径在组成和功能上的多样性和复杂性。与其他B7/CD28家族成员相比，PD-1/PD-L1途径广泛表达，并且在T细胞活化和耐受中发挥着广泛的免疫调节作用。PD-1/PD-L1途径可调节外周耐受的诱导和维持，并在生理条件下保护组织免受自身免疫攻击。

自身免疫性疾病是由针对正常人体内存在的物质和组织的异常免疫反应引起的，被认为是“常见复杂疾病”的异质性群体。它由免疫系统和自身抗原之间复杂的相互作用演变而来，涉及多种遗传属性、环境触发因素和多种细胞类型[5]。据统计，自身免疫反应影响着数百万人的免疫功能，导致了各种自身免疫性疾病，严重影响人们的生活质量，并显著缩短寿命[6]。B细胞和T细胞上存在的PD-1可以维持外周耐受并预防自身免疫性疾病的发生。下文将对PD-1/PD-L1在常见自身免疫性疾病中的研究进展做进一步讨论。

1 1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)

1型糖尿病(T1DM)是一种自身免疫性疾病，由胰腺Langerhans胰岛中产生胰岛素的β细胞的严重破坏引起[7]。非肥胖型糖尿病(non-obese diabetes，NOD)小鼠是1型糖尿病(T1DM)的自发模型，具有人类疾病常见的遗传和病理生理指标。一些已知的因素导致免疫耐受不足，引起疾病的发展，包括：产生自身抗体的B淋巴细胞，自身反应性CD4+和CD8+T细胞的扩增以及先天免疫系统的激活。PD-1或PD-L1阻断剂可迅速诱发1～10周龄糖尿病前期雌性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病，而雄性NOD小鼠在PD-1/PD-L1通路阻断后亦会发生糖尿病，这表明PD-1与PD-L1相互作用在NOD小鼠自身免疫性糖尿病的诱导和进展中起着核心作用[8]。将PD-L1在NOD小鼠胰岛β细胞上的表达上调也显著降低了胰岛炎和相关疾病发生[9]。NOD/PD-1基因敲除小鼠胰岛细胞中CD4+T-helper(Th)-1细胞的浸润增强，趋化因子受体CXCR3的表达增加，破坏性炎症反应增强，促进了糖尿病的发生[10-11]。因此，在NOD小鼠中，改变的PD-1/PD-L1信号传导与糖尿病有关。PD-1通过抑制胰腺T细胞的增殖和浸润来调节自身免疫，从而限制糖尿病的发生发展。使用活体显微镜进行的研究表明，PD-1阻断后，淋巴结中的T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号会被截断[12]，PD-L1阻断期间延长的细胞间相互作用会增强IFN-c的产生，破坏免疫耐受性，并最终促进T1DM的病理进展[13]。关于PD-1调节T1DM的机制，Fife等[12]提出PD-1/PD-L1通路可以影响TCR驱动的停止信号和T细胞运动。由于TCR驱动停止信号的抑制取决于PD-1和PD-L1之间的持续相互作用。因此，PD-1或PD-L1阻断可降低T细胞运动，增强T细胞与DCs的相互作用和自身免疫性糖尿病。一项研究表明，CD4+24ab Ⅱ型NKT细胞只有通过PD-1/PD-L1和ICOS/ICOSL途径，才能通过调节胰腺淋巴结中的致糖尿病性CD4+T细胞刺激来引起对T1DM的长期保护[14]。因此，PD-1/PD-L1信号与NOD小鼠糖尿病密切相关；PD-1可以通过抑制T细胞增殖和胰腺浸润调节自身免疫，限制糖尿病的进展。

2 多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统的一种炎症性脱髓鞘疾病，影响着全世界数百万患者[15]。活化T细胞上的PD-1与PD-L1之间相互作用可以抑制中枢神经系统中的T细胞反应。在脑内，PD-L1在内皮细胞上调，而PD-1，PD-L1和PD-L2在自身免疫T细胞上表达[16]。在MS的动物模型，即实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)中，中枢神经系统内PD-L1和PD-1表达增加，PD-1抑制可增强自身免疫性T细胞和抗体水平，导致EAE症状加速进展[16]。实际上，与PD-L2基因敲除或对照小鼠相比，PD-1和PD-L1基因敲除小鼠中具有较高的促炎性Th-1细胞因子(IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ)表达，EAE症状更为严重[17]。Wang等[18]发现PD-1 敲除小鼠免疫后Treg频率也降低了2～3倍，PD-1敲除T细胞在体外Treg转化出现明显缺陷；在体内，百日咳毒素(PT)治疗也下调了Tregs上PD-1的表达，但不改变其他表型特征。因此，Joller等[19]认为，PT可能降低Treg的稳定性和抑制功能，而PD-1通路促进了Treg的分化和功能，从而有助于抑制中枢神经系统炎症。PD-1/PD-L1信号在EAE进展中起着至关重要的作用，阻断该途径的治疗策略显示出抗MS的巨大潜力。

3 炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)

炎症性肠病(IBD)为一种累及回肠、直肠、结肠的特发性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，由环境、遗传、感染和免疫因素等多因素相互作用所致。现代研究表明肠道黏膜免疫平衡失调是导致IBD发生的中心环节，其中T淋巴细胞免疫调节失衡导致的促炎介质IL-1β和TNF-α的产生和分泌增加、炎症细胞的聚集和组织的破坏在其发病过程中发挥了重要作用[20]。在慢性结肠炎小鼠模型和IBD患者中，PD-1在T细胞上高表达，PD-L1在巨噬细胞、DCs、T细胞、B细胞和发炎的结肠组织上高表达[16]，均高于健康受试者[21-22]。注射抗PD-L1抗体，能减少炎症组织中Th1 CD4+T细胞(IFN-γ和TNF-α)的产生，但不减少Th2 CD4+T细胞(IL-4，IL-10)产生，提示PD-1/PD-L1可能参与炎症性肠病[23]。通过转移PD-1基因敲除T细胞或使PD-1/PD-L1信号通路失活，能诱导产生高Th1细胞因子的CD8+T细胞大量增加[24]。因此，PD-1/PD-L1相互作用的失活破坏了CD8+T细胞对自身肠道抗原的耐受性，从而导致了肠道自身免疫。此外，PD-L1敲除小鼠对三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)或葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的肠损伤具有高度敏感性[25]。这与其严重的病理特征相关，并引起共生细菌的过度增殖和上皮完整性的丧失，导致较高的发病率和死亡率。PD-L1的表达可以缓解肠道炎症，使CD11c+CD11b+固有层细胞的TNF-α表达降低，IL-22细胞因子的表达升高[25]。另外，在DSS处理的小鼠中注射表达Fc-PD-L1的腺病毒可减轻结肠炎[26]，说明PD-L1可能对缓解肠道炎症具有促进作用。Zuo等[27]前期研究亦发现UC肠道T细胞表面PD-1表达增加且与炎症严重程度呈正相关，可能对减轻肠道炎症具有代偿作用。PD-1/PD-L1对建立肠道黏膜耐受性具有潜在重要作用，促进PD-1与PD-L1结合可以诱导Treg的生成，抑制T淋巴细胞活化，建立肠黏膜耐受以缓解肠道炎症。

4 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性系统性炎性疾病，它影响了约0.5%～1%的普通人群[28-29]。在RA患者中，滑液和血浆可溶性PD-1的过度表达与关节计数和自身抗体产生显著相关，提示其可能在发病机制中发挥作用[30]。可溶性PD-1由IFN-γ、IL-17A和TNF-α诱导[31]。同样，与RA患者外周血的CD4+T细胞相比，滑液来源CD4+T细胞上表达的PD-1升高；与外周血髓样DC相比，滑液髓样DC上的PD-L1蛋白表达升高，并且与T细胞反应低下相关[32]。而刺激IL-7和阻断PD-1可显著增强T细胞增殖[32]。此外，与对照组相比，RA患者的巨噬细胞和滑膜T细胞中PD-1/PD-L1信号过表达[33]。特别是RA患者滑液中的可溶性PD-1表达水平与TNF-α水平显著相关。PD-1-/-小鼠的胶原诱导关节炎的发生率和严重程度上升，这与Ⅱ型胶原刺激T细胞增殖和细胞因子(IFN-γ和IL-17)分泌增加有关[34]。这些发现为PD-1/PD-L1途径在RA发病机制中的作用提供了初步的证据。当然，具体机制还需要在今后的研究中进一步阐明。

5 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)

系统性红斑狼疮(SLE)是常见的系统性自身免疫疾病之一，受遗传和环境因素的复杂病因影响，可累及多个不同的器官，并表现出不同的临床病程[35]。其诊断依据是皮肤、关节、肾脏和中枢神经系统的特征性临床表现，以及抗核抗体(ANA)等血清学指标，特别是抗dsDNA抗体(E1)阳性。Toll样受体和Ⅰ型干扰素这两个关键途径对于SLE发病机制很重要，并通过激活NF-κB和(或)STAT1来调节PD-1及其配体PD-L1的表达，PD-1和PD-L1在SLE发病及发展中扮演重要角色[36]。在动物模型中，PD-1-/-小鼠自身免疫性疾病发病率的增加表明了PD-1/PD-L1途径在维持T细胞耐受中的作用，T细胞耐受性被认为是自身免疫的负调节剂。如：PD-1缺乏的C57BL/6小鼠会发展为狼疮样自身免疫性增生性关节炎和肾小球肾炎，并伴有IgG3和C3补体沉积在肾小球上[37]。Mozaffarian等[38]研究了抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)对SLE中PD-L1的作用，他们观察到，来自活动性SLE患者的APC具有其他共刺激标记(例如CD80和CD86)的表达，但PD-L1并没有上调。对这一发现的合理解释可能是狼疮APC在狼疮发作期间刺激T细胞活化的异常强的能力。PD-1、PD-L或两者的表达降低会导致SLE的免疫耐受紊乱。据报道，PD-1在SLE患者T细胞和B细胞上过表达，而PD-L1在B细胞上过表达[39]。在SLE中，PD-1+滤泡辅助性T细胞(Tfh)细胞的数量随疾病的严重程度而增加[36]。Tfh细胞上的PD-1表达在SLE患者淋巴结生发中心不充当免疫抑制受体，而与循环Tfh细胞增加无关。循环Tfh细胞的这种增加与SLE患者自身抗体的产生和终末器官损伤的增强有关[40]。在SLE患者和健康组中，CD25highTreg上的PD-1表达均显著高于CD25low效应T细胞。然而，与健康个体相比，SLE患者中CD25highTreg上的PD-1表达水平明显降低[41]。PD-1/PD-L1作为维持Treg对效应T细胞的抑制作用必需的途径，可以提示PD-1对Treg的下调会导致SLE中Treg的数量和功能降低。

6 强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)

强直性脊柱炎(AS)是轴向骨骼的炎性自身免疫性疾病，经常与人体白细胞抗原(HLA-B27)相关。在AS中，HLA-B27分子与抗原肽结合，从而将其呈递给CD8+T淋巴细胞[42]。已经有报道指出，在AS中具有CD4+和CD8+细胞功能紊乱的异常免疫表型[43]。Bautistacaro等[44]观察到，相比较于用TNF阻滞剂(AS/b)治疗的AS患者，未使用TNF阻滞剂的AS患者(AS/nb)循环CD4+CXCR5+ICOS+PD-1+Tfh细胞和浆母细胞减少，同时(Tfh-Th17+Tfh-Th2)/(Tfh-Th1)比率降低。此外，他们发现AS/nb患者的外周血CD4+CXCR5+T细胞帮助B细胞离体的能力较低，这可能提示CD4+CXCR5+ICOS+PD-1+Tfh细胞和浆母细胞可能被隔离在肠道相关淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)中，并且肠道中的先天免疫机制在AS的发病机理中起决定性作用。相反，Xiao[45]等研究表明，与健康个体相比，AS患者中CXCR5+CD4+PD-1+T细胞的频率显著增加。PD-1+CXCR5+CD4+T细胞频率增加可能源于免疫系统的自发性补偿调节，从而对AS患者的自身免疫反应产生负调控作用。在另一个实验中，Chen等[46]评估了PD-1在AS患者免疫细胞中的表达，并研究了CD4+CD25highTreg细胞。与健康对照相比，AS患者的CD4+CD25highTreg数量没有增加。此外，来自AS患者的PBMC中PD-1水平没有显著高于RA患者或年龄和性别匹配的健康对照组，并且也与AS患者的临床表现无关。然而，AS患者中PD-1+CD3+T细胞和PD-1+CD4+T细胞的百分比显著降低。该研究得出的结论是，缺乏PD-1的T辅助细胞数量可能与AS患者的脊柱放射学改变有关[46]。

总之，作为诱导和维持T细胞活化和耐受以及外周耐受的关键调控因子，PD-1/PD-L1通路在多种自身免疫系统疾病的发生与发展中发挥着重要作用。这一生物学意义揭示了通过拮抗剂或激动剂操纵PD-1/PD-L1通路来对抗这些疾病的治疗策略的发展。目前，针对这些通路的疗法正在研究中，但结果尚不太理想，仍然需要不断探索其具体作用机制，争取早日开发出有利的治疗工具，更好地改善患病人群的生活质量。