鸡蛋清溶菌酶分离纯化研究进展

明 辉，李 浩，徐 婷

（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾644000）

0 引言

溶菌酶是一种对人体无毒无害的天然蛋白，可以作为一种抗菌蛋白，杀灭部分革兰氏阳性菌，因此被广泛应用于食品加工领域，作为食品防腐剂应用于食品保鲜、食品贮藏[1-2]等方面。由于其抗菌和抗生素，溶菌酶还可以提高免疫力和治疗多发炎症[3]。在禽类的饲料中添加少量溶菌酶，能够抑菌防腐、延长饲料的贮存期，还可以提高禽类的抗病能力、存活能力和生长速度[4-5]。在包装行业中，用经溶菌酶处理的包装纸包装馒头时，可以使其延长1周而不变味。因此，食品工业、动物养殖业和疾病防治等都需要大量的溶菌酶。据估计，全世界每年商业使用溶菌酶超过了100 t。而高纯度、高活性溶菌酶一直是近年来食品与医院界的研究热点。

目前，鸡蛋清溶菌酶分离纯化的技术主要有两大类，第一类是放大法，主要是采用超滤法、沉淀法、盐析、离子交换法等；第二类为实验室规模，主要有亲和层析、色谱法、反胶束等。对鸡蛋清溶菌酶分离纯化技术近年来取得的成就进行综述。

1 超滤法

1.1 超滤原理

超滤法是利用膜两侧压力差，通过不同超滤膜的孔径，将分子量不同的混合物进行分离，使小分子通过膜，而大分子被截留，从而实现对酶的纯化[6]。该方法操作简单方便，且酶不容易失活，但也存在膜易堵塞、操作时间较长等缺点。

1.2 超滤的基本过程

应用超滤法分离纯化鸡蛋清溶菌酶，一般采用两步法，第一步将料液经过50kDa的PES膜进行超滤，主要除去大部分杂蛋白，第二步再进行30 kDa PES膜超滤。由于超滤法分离蛋白质受操作条件和物理化学条件的强烈影响，因此需要非常精确的过程才能有效分离蛋白质，为了确定最佳的条件，可以通过改变压力、搅拌速度、pH值等工艺参数。

1.3 影响因素

1.3.1 pH值

研究发现不同的pH值随时间变化对分离特性有很大影响。Datta D等人[7]选择3种不同的pH值下进行检测。一种是低于卵清蛋白的等电点2.5，一种是高于卵清蛋白的等电点5.5；另一种是在卵清蛋白的等电点，即4.5。膜通量在pH值5.5时最小，由于蛋清中大多数蛋白质的等电点在4.5～5.5。因此，蛋白质在pH值5.5时的总电荷是可以忽略的。又由于膜表面沉积的蛋白质之间并无静电斥力，沉积层变密集，浓差极化现象影响变大[8]，分子簇形成可能会阻碍溶质分子的渗透[9]，进而造成膜通量减少。在pH值2.5的条件下，偏离了鸡蛋清中的卵清蛋白等电点，使得卵清蛋白带正电，而蛋清中大多数蛋白带正电，保留了在表面的蛋白质分子之间的静电排斥作用，渗透量会很高，静电斥力会降低浓差极化，降低膜阻力，从而产生更高的膜通量。在pH值4.5时，为鸡蛋清卵清蛋白的等电点，溶液中蛋白质分子间的静电斥力接近于零，蛋白质分子处于离散化，在膜表面形成的凝胶导致蛋白质的最大析出，从而使得膜通量较小，渗透浓度较低[10]。

1.3.2 跨膜压力

压力是影响膜通量的重要因素，由于施加在膜表面的驱动力变大，膜通量则会随着操作压力的增加而增大。随着时间的推移，渗透通量先会迅速下降，然后逐渐下降，最终放平缓。在低压力下，膜通量的下降速率会更快，这可能是由于膜表面的浓差极化形成了凝胶层，对膜通量产生了阻力。随着驱动力的减小，浓差极化产生的凝胶层的厚度增加的更快。然而，压力过大也会加速某些组分在膜中的沉积，造成膜孔减少甚至堵塞，最终使得膜通量和蛋白质得率降低[11]。

1.3.3 搅拌速度

不搅拌的情况下，蛋白质容易沉积在膜表面，导致浓差极化增大，膜通量和蛋白质回收率降低。而研究发现通过增加搅拌，膜通量随着搅拌次数的增加而增加，蛋白的回收率也逐渐提高，这是由于带有高剪切装置特性的膜表面的涡流增强。高通量可能的原因是搅拌时，靠近膜的进料也会旋转，并将沉积的溶质从膜表面给扫走，减低了浓差极化，同时增加了渗透速率。Datt D等人[7]研究表明，搅拌速率50～200 rpm，蛋白回收率从82.3%提高到了98.7%。

1.3.4 进料浓度

不同的进料浓度对渗透通量有不同的影响。初始浓度越高，通量下降的速率也会越快。并且容易形成显著的膜污染，这是由于特定的膜-溶质相互作用引起的[7]，而这些不溶物将会沉积在膜表面造成膜堵塞，从而导致膜通量的下降[12]。不管是表面沉积还是膜污染，膜的固有阻力都会发生变化，这是由于物理化学的相互作用。进料浓度对分离特性也会产生影响，虽然低进料浓度可以提高渗透速率，但渗透液中总蛋白和单个蛋白浓度会显著降低，这主要是由于水相与蛋白质分子的渗透。通过对进料浓度进行优化，可以使渗透通量和渗透蛋白浓度保持在满意的范围内。

2 食盐直接结晶法

2.1 结晶的基本原理

结晶是物质在过饱和度或过冷度的驱动下从蒸汽、溶液或熔融体中以晶体形态析出的过程。该过程包括形核和晶体生长。目前，主要的结晶方法有批量结晶[13]、液-液扩散结晶[14]、蒸汽扩散结晶[15]和透析结晶[16]。该方法操作简单，但花费时间较长，短则数天、数周，长则数月。

2.2 结晶的基本过程

鸡蛋清溶菌酶结晶，是通过溶菌酶具有耐热耐酸性，且在盐溶液中易析出，通过调节工艺参数，让蛋白溶液达到过饱和，从而使得溶菌酶形成晶体，并从溶液中析出来。结晶法是鸡蛋清溶菌酶分离纯化最为常用的方法，该方法先利用等电点沉淀，调节蛋清的pH值到4.5，再利用溶菌酶的热变性加热数分钟，除去大量的杂蛋白后，加入NaCl作为沉淀剂，调节pH值至溶菌酶的等电点10.7。再加入溶菌酶晶种，进行诱导结晶。低温下放置大概1周，观察到析出大量溶菌酶晶体，从而实现与其他杂蛋白的分离。若要获得纯度更高的溶菌酶，可通过上述方法重复结晶。但蛋白质晶体的形成，受到结晶条件的影响，结晶过程只要有细微偏差，晶体的质量和得率都会受到很大影响。因此，为了得到高质量的晶体和更高的产率，就有必要确定最佳的结晶条件。

2.3 影响因素

2.3.1 盐浓度

研究表明，通过调节不同的盐浓度，得到的晶体质量有明显差异，随着盐浓度的增加，溶菌酶得率会增加，这是因为盐浓度的增加，增大了溶液的过饱和度，从而影响晶体的数量和质量，但是随着盐浓度的增加，会在溶液中观察到不规则晶体和海胆或球粒陨石的存在，过多的盐会导致晶体质量明显下降。

2.3.2 温度

不同的蛋白质需要的结晶温度不一样[17]，由于溶菌酶的溶解度随着温度的升高而逐渐增大，故溶菌酶结晶在低温下更易析出。然而，逐渐变化的温度能使溶菌酶形成的晶体形貌较好，在恒温下的晶体质量与在逐渐变化的温度相比，会出现更大的缺陷，如出现裂纹、易破裂等，并且纯度较低[18]，故结晶最好在低温下，且温度逐渐变化下最好，这是因为晶体在形核区形核，在亚稳区生长。通过控制温度的变化，让晶体达到理想生长区域，并且在低温下溶菌酶能保持更好的活性。

2.3.3 pH值

通常情况下，晶体会在靠近蛋白溶液的等电点附近析出；相反，远离等电点则不利。这是由于溶液pH值的改变会引起蛋白质分子所带电荷的改变，从而影响蛋白质溶解度的改变[19]。而蛋清中的蛋白质大多等电点都在4.5～5.5，而溶菌酶的等电点为10.5～11.0，故先调节其他杂蛋白的pH值，让其析出。进行离心分离之后，再调节溶菌酶的等电点。

3 离子交换法

3.1 离子交换法的原理

离子交换法是应用离子交换剂分离蛋白溶液中的蛋白质，由于蛋白质分子带有不同的电荷，其与离子交换剂的基团有不同的强弱结合能力，从而能够实现不同蛋白的分离纯化。根据蛋白溶液及其分离的要求，选择合适的离子交换剂。

3.2 离子交换的过程

由于溶菌酶是碱性蛋白酶，因此一般使用弱酸性阳离子树脂作为离子交换剂。这是由于弱酸性阳离子树脂能够与蛋白溶液中的阳离子进行结合吸附，从而产生离子交换作用。使用之前，对购买的树脂进行预处理，即用3倍体积的95%乙醇浸泡24 h，然后对其中的无机杂质用酸洗涤，有机杂质用碱除去，洗至中性即可。再用4～5倍体积的蒸馏水中和树脂[20]。将处理好的树脂小心灌入柱中，再将蛋清液加入树脂中使其充分吸附，并在4℃下缓慢搅拌，以达到吸附平衡，吸附完成后，通过离心去除上清液，收集树脂，然后用蒸馏水进行洗脱，离心除去上清液，再加入盐溶液，搅拌混合后，进行洗脱、离心，收集上清液。该方法具有样品处理量大、回收率高、活性保持良好、分离周期相对较短、价格低廉、可自动化连续生产等优点，是目前分离纯化溶菌酶的常用方法。

3.3 影响因素

3.3.1 离子交换剂的类型

姜馗[21]以D152型阳离子交换树脂为介质，通过对一系列参数的优化，得到的溶菌酶回收率为86.6%，活性为20 000 U/mg，洗脱下来的溶菌酶纯度达到了100%。李欣[22]用DEAE-纤维素阴离子交换层析法分离鸡蛋清溶菌酶，得到的溶菌酶收率为60%，酶活为15 000 U/mg，溶菌酶纯度超过99.5%。李宗孝等人[23]采用724型阳离子交换树脂提取溶菌酶，选用1%的H2SO4溶液洗脱，溶菌酶收率为14%。宋宏新等人[24]采用724型阳离子交换树脂提取蛋清溶菌酶，分别用了动态交换法和静态交换法，吸附率分别达到了83.5%，74.8%，其回收率达100%。

3.3.2 温度

通过分析不同温度条件下溶菌酶的吸附情况，表明随着温度的增加吸附量会明显增加。低温不利于溶菌酶的吸附，在12℃以上的温度时吸附量的增加趋势会逐渐变缓[21]。

3.3.3 pH值

通过调节pH值范围在4～10时，发现不同pH值时的树脂对蛋清溶液进行吸附所得到的溶菌酶其纯度都较高。研究还发现，不同的pH值对溶菌酶的收率和活力会有较大的影响，在pH值接近中性时比pH值偏酸或偏碱时得到的溶菌酶收率和活性要好[25]。这是由于溶菌酶是碱性蛋白，其等电点在10.7左右，故在偏酸性条件下较稳定。

3.3.4 蛋白质浓度

研究发现，对蛋清稀释不同的倍数，溶菌酶的回收率会不同。当蛋清液稀释1倍时，回收率为82.2%，当蛋清液稀释2倍时回收率为84%[21]。当蛋清稀释1倍或者2倍时，洗脱下来的所获得的蛋白纯度都较高，基本为溶菌酶，然而随着浓度的逐渐降低，洗脱液所得到的溶菌酶纯度就会变低，这是由于树脂会吸附其他杂蛋白，破坏了树脂与溶菌酶的专一性吸附。由此表明，当蛋清浓度适中时，树脂所吸附到的溶菌酶的回收率就会增加。

4 亲和色谱法

4.1 亲和色谱法的原理

亲和色谱法通常是色谱法中选择最高的一种，利用酶和底物，或者抗原抗体的特异性相结合，将特异性结合的一方作为固定相，利用与固定相不同的亲和度进行分离，并选择性地吸附物质，再通过洗脱分析所需物质[26]。

4.2 亲和色谱法的过程

通过制备亲和层析介质作为填料，然后进行平衡，将预处理的蛋清进行装柱，进行专一性亲和吸附，吸附后进行洗脱。在整个洗脱过程中有一个单一的色谱峰，表明在流动缓冲液中能有效洗脱被吸附的蛋白质[27]。该方法操作简单、选择性高、分离出的蛋白能够保持较好的活性等。

4.3 影响因素

4.3.1 pH值

和离子交换法类似，色谱法也同样是在pH值偏中性时，溶菌酶的吸附量最大。在偏酸和偏碱性pH值条件下，溶菌酶的吸附明显降低。表明介质pH值对溶菌酶的吸附平衡有重要影响。pH值为7时，介质与溶菌酶直接存在优先的相互作用。这可能是离子交换和疏水相互作用的结果[28-29]。

4.3.2 盐浓度

树脂对溶菌酶的吸附量会随着盐浓度的增加而逐渐降低。这是由于随着离子强度的增加，介质对溶菌酶的吸附能力降低，这可能是由于介质与溶菌酶之间的静电相互作用减弱导致的[30]。一般选用的介质都含有疏水基团和带电基团，在吸附的整个过程中，这2种力就会相互结合。

5 萃取法

5.1 萃取原理

萃取法是通常分离液-液混合物的方法，是根据溶质在两种互不相溶的溶剂里溶解度或分配系数的不同，使得溶质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂里提取出来的方法[31]。

5.2 萃取过程

萃取过程一般分为3步，即萃取、洗涤和反萃取。首先，将鸡蛋清预处理，然后与萃取剂进行混合，充分振荡，完成萃取。经过离心将得到的液体相再加入盐溶液，进行反萃取操作，之后离心、脱盐、冷冻干燥得到产品。

5.3 影响因素

5.3.1 pH值

考虑到碱性条件可能会破坏溶菌酶的活性，故通过调节萃取体系的pH值2～9，发现pH值和离子强度的变化对萃取效率没有显著影响[32]。可能是由于溶菌酶所带电荷在所研究的pH值范围内没有发生变化，没有静电相互作用。因此，pH值和离子强度对萃取的影响可忽略不计。

5.3.2 萃取剂用量

随着萃取剂用量的增加，萃取率先是逐渐增加，之后会略有下降，这可能是由于萃取剂和溶菌酶在顶部的相形成了聚集体。随着萃取剂用量的增加，顶层相的体积相应增大，导致体系的相形成能力增强[32]。因此，聚集体会将更多的溶菌酶转移到顶层。当萃取剂用量过多时，萃取的能力会受到抑制，这可能是由于萃取剂的相空间有限，趋于饱和，过量的萃取剂溶剂在水相中，导致萃取效率下降。

5.3.3 盐浓度

盐浓度也是影响萃取过程中的一个关键因素。盐浓度提高，萃取率会得到明显的提高，这可能是由于盐的浓度增加，盐析效果增加，疏水性增加，导致溶菌酶在低相中的溶解度降低。使得更多的溶菌酶迁移到了顶层。但当盐浓度过多时，萃取率开始下降，可能的原因是随着盐浓度的进一步增加，顶部相的含水量被拖入到底部相，因此顶部相体积急剧减小，溶菌酶下降[31]。

6 其他方法

近年来，越来越多的研究者通过合成吸附剂来分离纯化溶菌酶，如Wang X等人[33]使用了分子印迹技术对溶菌酶进行分离纯化，通过以溶菌酶为模板，丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体，制备了Lys-MIPs[34]，然后通过Lys-MIPs柱，从蛋清中分离出溶菌酶。Chiu H T等人[35]报道了一种离子交换纳米纤维膜，通过膜和搅拌细胞反应器直接从鸡蛋清中纯化溶菌酶。蛋白回收率为22.3%，再经纯化后回收率达80.5%。Cheng C Y等人[36]研究了一种环保型聚乳酸稻壳灰混合基质膜用于纯化鸡蛋清溶菌酶，溶菌酶的回收率为70%，纯度接近100%。Luo R P等人[37]采用磁性纳米粒从新鲜蛋清中分离出溶菌酶，并考查了酶浓度、吸附时间、pH值、离子强度等因素，其含量达113±4.2 mg/g，酶活达16 370±46 U/mg。

7 结语

溶菌酶的用途十分广泛，尤其是高纯度、高活性的溶菌酶，需求量越来越大，其分离纯化的工艺一直是研究者关注的热点。近年来，鸡蛋清溶菌酶的分离纯化技术发展迅速，其方法也是多种多样，可根据所需的要求采用不同的分离纯化手段，以获得更高质量的溶菌酶。单一的分离纯化方法，可能存在回收率低、纯度不高等情况，因而更多的研究者会选用多种方法结合，如Ji S等人[38]通过连续使用沉淀法，后又经离子交换、超滤等方法，对蛋清中的5种主要蛋白进行了分离，得到溶菌酶的纯度高于90%，高于77%。又如，Chen C等人[39]开发了亲和膜色谱和染料配体色谱法，用于溶菌酶的纯化，其在规模化的生产中，取得了高效益，在工业上得到了广泛的应用[40]。因此，研究者可以充分利用溶菌酶的耐热性、耐酸性、溶剂性等特点，通过改进分离纯化的手段，合理地将结晶法、色谱法、萃取法等结合使用，以达到有效的回收率和纯度。