常压室温等离子诱变选育微生物的研究进展

徐礼生，于巧玲，张兴桃，蒋变玲，李婷婷

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州234000）

0 引言

常压室温等离子体诱变（ARTP）是在常压室温下产生高浓度均匀等离子体射流，这种射流与细胞作用明显，产生高密度高活性均匀粒子，诱变所需温度低。与传统的物理诱变技术相较具有明显优势，所以在工业生产中常被使用[1-2]。ARTP通过高活性粒子可改变微生物核苷酸结构进而诱变得到目的细胞产物，使突变株具有良好稳定性，无需真空装置，操作简单[3]。虽然，化学诱变在单独和复合作用较为明显，但在化学诱变应用过程中易引起的环境污染问题。ARTP系统DNA损伤大，突变率高于化学诱变和紫外线诱变。在ARTP系统中以氦气作为主要气体，不会产生有害物质[4-5]。

1 ARTP在细菌诱变方面的应用

ATRP技术诱变产生枯草芽孢杆菌，通过以不产生脂肽作为筛选标记得到高产菌株[6]。常压室温等离子诱变脱氮假单胞菌，将目的基因进行扩增导入脱氮假单胞菌，通过ARTP诱变处理产生高效高产的维B12产生菌，通过高通量筛选出高产菌株[7]。袁红梅等人[8]通过ARTP诱变枯草芽孢杆菌使其产生大量腺苷，腺苷产生菌对于ARTP特别敏感，经过初筛和复筛得到高产腺苷高产菌。利用ARTP选育微生物谷氨酰胺转胺酶高产菌株茂源链霉菌，通过其诱变致死率和突变率计算，高通量筛选和复筛选育出目的菌种进行培育[9-10]。利用氦作为工作气体的大气等离子体（ARTP）处理新金分枝杆菌方法，突变体中新奥金菌被认为是工业应用最佳菌株[11]。ATRP技术对植物乳杆菌进行诱变，通过单因素试验，以及溶钙圈法和酸度测定等测试方法选育出产酸量高且发酵稳定乳酸菌菌株，不仅操作简便，同时节约成本[12]。ARTP通过高密度的粒子流，可与生物大分子作用改变细胞结构，使细胞遗传物质结构发生突变（碱基的缺失替换等）并且结合不同的筛选方法选育所需菌株。研究枯草芽孢杆菌BS120，对其进行ARTP等离子诱变处理，以8-氮寡霉素和鸟嘌呤作为筛选拮抗物筛选遗传稳定且核黄素产量高的菌株[13-14]。ARTP等离子诱变红霉素产生菌红色多糖多孢菌，结合紫外进行复合诱变，使菌株平均发酵效价较出发菌提高了25.2%[15]。常压室温等离子体-紫外复合诱变育β-法尼烯高产菌株大肠杆菌，通过复合诱变进一步提高了正突变株的突变率，正突变率提高43.3%[16]。常压室温等离子诱变技术可有效地通过高密度的活性粒子与生物大分子作用，或者通过改变细胞膜的通透性进而改变遗传物质的结构，达到诱变育种目的[17]。

2 ARTP在真菌诱变方面的应用

常压室温等离子诱变技术在真菌方面也具有重大应用价值，该技术在黑曲霉菌、米曲霉菌、红曲菌等真菌诱变育种应用广泛[1]。研究单宁酶高产菌株黑曲霉，ARTP可快速诱变黑曲霉，通过固态摇瓶发酵和液态摇瓶发酵，得出菌株酶活性是出发菌株的1.64倍。由此得出，在最佳时间、温度、单宁酸浓度、葡萄糖浓度在经过ARTP诱变处理的黑曲霉菌株产单宁酶效率显著提高[18]。曲酸是微生物有氧发酵具有抑制酪氨酸酶作用的有机酸，可作为食品防腐剂、美白剂或保鲜保色剂等。通过ARTP技术对米曲霉进行诱变处理，再通过96孔板高通量筛选得到了曲酸产量稳定的米曲霉菌株，较出发菌株曲酸产量增加31.48%[19]。红曲菌是产橙和黄色素的一种真菌，可以作为食品生产中的着色剂。通过物理诱变紫外超声波和化学诱变硫酸二乙酯，氯化锂诱变红曲菌。但是，这2种方法突变率低，成本高且后者对环境有污染，通过利用ARTP技术，选择高产菌M1代培养，经18代传代培养，色素吸收光谱图显示橙，黄色素较出发菌有明显增加[20]。研究高产木糖醇产生菌酵母念珠菌，通过ARTP技术突变得到200多个突变菌株，选育出产量最高T13[21]。对桑黄原生质体进行ARTP等离子诱变，黄酮产生量提高86.7%，进而证明ARTP干预了桑黄菌体内产生黄酮化合物的代谢过程[2]。

3 ARTP在酵母诱变方面的应用

常压室温等离子诱变技术在丝孢酵母、酿酒酵母和粘红酵母等方面的应用。利用ARTP诱变技术诱变丝孢酵母，对其遗传物质产生损伤，引起细胞内的修复系统产生错配位点，通过96孔板结合对硝基苯酚棕榈酸酯高通量筛选，获得具有稳定遗传菌株[22]。通过等离子射流对酒酿酵母单细胞进行诱变处理，选择致死率为90%～95%反复诱变，最终筛选出了1株比出发菌RNA产量提高了39%的遗传稳定突变株[23]。通过从酵母菌中选育一株相对最高产的菌株进行ARTP处理，将其RNA的含量提高了160.54%[24]。研究产生油脂的粘红酵母，通过在120 W常压室温等离子诱变30 s，粘红酵母的基因序列受到破坏，经过发酵优化使其产脂量提高17.59%[25]。

4 ARTP在微藻诱变方面的应用

ARTP等离子诱变技术在微藻方面也具有普遍应用。研究ARTP等离子诱变对螺旋藻氨基酸含量的影响，经过ARTP等离子诱变技术选育出的螺旋藻突变菌株[26]。通过对油脂富含丰富的湛江等鞭金藻进行ARTP等离子诱变处理，得到了较原始菌株高产油脂的突变菌株，且可稳定遗传[27]。虾青素是一种具有强氧化力的类胡萝卜素，具有延缓衰老、美白、提高人体自身抵抗力、抗癌的优点。吴晓英等人[28]通过ARTP技术在100 W的输出功率，气体流速10 L/min下处理40 S破坏其遗传物质的结构，通过虾青素合成抑制剂作为筛选剂，筛选出高产虾青素比出发菌提高了52.96%的突变株。利用ARTP等离子诱变技术，经过选育得到最高产量较出发菌提高了33.85%的菌株，经过验证该菌具有诱变作用且遗传稳定。

5 结语

常压室温等离子诱变技术是通过其高密度的高活性粒子流，破坏细胞膜的通透性，导致遗传物质的基因序列发生破裂，引发修复系统出现许多突变序列位点，再控制合适的输出功率和时间等条件，可使出发菌株快速突变出现较高致死率，选育高产菌株。ARTP技术在微生物育种方面具有明显的优势，大大提高微生物在工业生产中应用效果。