microRNA在乳腺癌中的研究进展

李亚南，金春明，尹贵彬

(牡丹江医学院1.研究生处；2.附属红旗医院检验科，黑龙江 牡丹江 157011)

乳腺癌居女性恶性肿瘤发病率首位，严重威胁女性身心健康。自1940年第一次有数据记录以来，乳腺癌发病率呈直线上升趋势，20世纪80年代至21世纪这一趋势更甚[1]。对于乳腺癌来说，乳腺钼靶是主要诊断方式，外科手术切除术是主要治疗方式。晚期浸润型乳腺癌患者死亡率较高，但早期乳腺癌患者可得到较好的治疗从而大大降低死亡率，因此，尽早诊断乳腺癌，成为提高乳腺癌患者整体生存率的关键。microRNA是短RNA，是转录后调节基因表达的内源性小核糖核酸；microRNA是基因表达的关键调节剂，可通过与靶标结合来减少基因表达。计算预测表明，所有人类基因都可能受microRNA调控，每个microRNA可能靶向数千种基因，几个microRNA也可调控同一个基因。近年来，microRNA表达谱显示与肿瘤的发生、发展和预后有关，提示它们可作为预测型、诊断型和预后型生物标志物。这为乳腺癌可被更好的预测、诊断及预后提供了可能性。

1 microRNA

microRNA是长度约19-25个核苷酸的短RNA，通过与信使RNA(mRNA)3’非翻译区(3’UTR)的特异性结合而抑制其表达,从而起到调控基因表达的作用。microRNA的成熟经过几步过程：最原始的microRNA初级转录产物(pri-miRNA)，在细胞核中由人类微处理器经 Drosha酶初次加工成为microRNA前体(pre-miRNA)；pre-miRNA再经过Dicer酶两次剪切后，成为成熟microRNA。microRNA“种子区”(即2-8位核苷酸)与中心区(即9-12位核苷酸)可互补结合，具有高度互补性的microRNA与靶标相互作用导致mRNA降解；而互补性较低的microRNA与靶标可以通过翻译途径起抑制作用，这是microRNA抑制基因表达的两个主要途径。

2 microRNA与乳腺癌

2005年Iorio等首次提出了microRNA在乳腺癌乳腺癌组织中存在着差异表达，近年来的研究表明，microRNA在乳腺癌中起到抑癌或致癌作用。

2.1 具有致癌作用的microRNA(1)microRNA-21：Anwar SL起初研究了102名不同亚型和不同阶段的乳腺癌患者(还包括15名健康女性)，在手术和化疗治疗后收集了患者的静脉血，对从患者血浆中分离出的microRNA-21进行定量，乳腺癌患者中microRNA-21含量明显升高，而在乳腺癌患者完成手术后，microRNA-21含量明显下降。这一实验表明，microRNA-21不仅能够作为乳腺癌非侵入性的生物标志物，其有着致癌作用，还可以作为乳腺癌治疗监测的一项指标[2]。Wang H等运用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对比了252位乳腺癌患者、82位良性乳腺肿瘤患者及127位健康对照的血浆及乳腺癌细胞系中的microRNA-21水平，用荧光素酶活性测定法证实了microRNA-21对亮氨酸拉链转录因子样1抗体(LZTFL1)的靶向调节作用。实验结果显示，乳腺癌患者血浆中microRNA-21水平较正常人高，microRNA-21直接靶向调节LZTFL1促进乳腺癌细胞的增殖和转移[3]。Xie Y运用微阵列分析选择出高表达的microRNA-21-5p与低表达的丝裂原激活蛋白激酶10(MAPK10)，癌组织中microRNA-21表达水平明显高于癌旁组织，而MAPK10则正好相反，这一实验表明microRNA-21通过抑制MAKP10来促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡。三阴型乳腺癌(TNBC)是乳腺癌分类中预后较差、死亡风险较高的一种。TNBC的早期发现与治疗诊断是乳腺癌专家研究的热门。长非编码RNA(lncRNA)AWPPH于早期实验被证实在肝癌和膀胱癌中起致癌作用[4-5]，Liu An在近期的研究中发现，TNBC患者血浆中的lncRNA AWPPH和microRNA-21水平较健康对照组上调，其lncRNA AWPPH和microRNA-21水平呈正相关，它们可能通过彼此相互作用来调节TNBC中癌细胞的增殖和化学敏感性[6]。(2)microRNA-155：葡萄糖代谢是机体生物供能的主要活动之一，microRNA-155的过表达会通过上调葡萄糖转运蛋白以及包括己糖激酶2(HK2)，丙酮酸激酶M2(PKM2)和乳酸脱氢酶(LDHA)在内的代谢酶的表达，进而促进葡萄糖的摄取和糖酵解，其作用是通过PIK3R1-FOXO3a-cMYC轴积极调节乳腺癌的葡萄糖代谢产生的[7]。Zhang MH通过免疫组化方法评估了microRNA-155和上皮间质化(EMT)标记蛋白(波形蛋白，平滑肌肌动蛋白[SMA]，骨连接蛋白，N-钙黏着蛋白，E-钙黏着蛋白，CD146和ZEB1)表达水平之间的关系，得出microRNA-155与EMT标记物的表达呈负相关，说明microRNA-155可作为乳腺癌的预后标志物，值得注意的是高水平的microRNA-155表达与更好的远处无转移生存期(DMFS)相关。细胞粘附分子1(CADM1)起到抑癌作用，其已被确定在乳腺癌中经常失活，并且与患者预后不良和晚期TNM分期密切相关。Zhang G等用荧光素酶法和免疫印迹(Western Blot)分析确定CADM1和microRNA-155-3p之间的关系。microRNA-155-3p在乳腺癌组织和细胞中上调，CADM1的mRNA和蛋白水平与检测到的microRNA-155-3p的表达正相反，此实验说明microRNA-155-3p可能对乳腺癌细胞中的CADM1表达产生负调控，通过下调CADM1的表达来加速乳腺癌的进展。Pax-5是B细胞发育中必不可少的转录因子，在各种B细胞癌病变和实体瘤(如乳腺癌)中表达异常。核因子-κB (NF-κB )蛋白最早由David Baltimore发现，在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起关键作用。NF-κB 的错误调节会引发自身免疫病、慢性炎症以及很多癌症，Harquail J等发现Pax-5通过调控microRNA-155及其下游靶标IKKε进而抑制NF-κB信号传导，最终促进乳腺癌的发生、发展。(3)其他致癌microRNA：癌症基因组图谱中数据显示，microRNA-3677在乳腺癌组织中表达上调，Peng LN等发现其新的靶基因，即转导蛋白样增强子3(TLE3)，且microRNA-3677与TLE3的表达在乳腺癌组织中呈负相关，有理由推测microRNA-3677通过抑制TLE3的表达来促进乳腺癌细胞的增殖迁移[8]。早前数据表明，Circ-0007255是乳腺癌的一项新兴预后指标。Jia Q通过实验证明了它的功能作用机制，即Circ-0007255通过调节microRNA-335-5p/SIX2轴促进乳腺癌细胞生长迁移，在乳腺癌中起致癌作用[9]。microRNA-4472在高度转移性乳腺癌中明显上调，其表达量与肿瘤大小和TNM分期呈正相关。反义导向分子RGMA抗体(RGMA)被确定为microRNA-4472的直接靶标，microRNA-4472的过表达抑制E-钙粘蛋白，启动波形蛋白和β-连环蛋白(β-catenin)，从而下调靶基因RGMA的表达，并加快EMT进程，最终消除RGMA的肿瘤抑制作用，促进乳腺癌的发展[10]。RAS样雌激素调节生长因子(RERG)是乳腺癌中的一种肿瘤抑制因子，RGRE和microRNA-532-5p的表达在乳腺癌中呈负相关，microR-532-5p的过表达抑制RGRE的表达，同时激活MAPK/ERK信号传导通路，即microRNA-532-5p通过MAPK/ERK通路直接靶向抑制RGRE以促进乳腺癌的增殖迁移[11]。Li D等实验发现，microRNA-937-3p在乳腺癌组织中表达上调，趋化因子受体2(CCRL2)在乳腺癌中表达下调。因此，microRNA-937-3p通过靶向CCRL2促进乳腺癌细胞的增殖迁移，进而促进乳腺癌发展。

2.2 具有抑癌作用的microRNA(1)microRNA-195：microRNA-195在胃癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌中表达均下调。Zhao FL等选择102名健康受试者和210名乳腺癌受试者的样本进行microRNA-195水平的比较，microRNA-195水平在乳腺癌患者中明显下调，尤其是早期乳腺癌患者，因此，microRNA-195可作为早期诊断乳腺癌的生物标志物且具有极高的敏感性[12]。大量文献表明，高度增殖的癌细胞需要从头合成脂肪酸才能形成膜产生能量，Singh R等从这一思路出发，证明microRNA-195可以靶向乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶(二者均为从头合成脂肪酸的关键酶)来减少乳腺癌EMT。确立了线粒体功能障碍和脂质代谢是microRNA-195影响乳腺癌发展的主要途径。Yang G等研究表明，microRNA-195的上调提高了乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。其他研究表明，microRNA-195可结合B淋巴细胞瘤2(BCL2)的3'UTR负向调控乳腺癌。(2)microRNA-30a：Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中非常保守的通路。Wnt基因首次于1982年小鼠的乳腺癌细胞中发现，后续研究发现果蝇的无翅基因与其基因功能相似，均可以操控胚胎的轴向发育，于是将两者并称为Wnt基因。microRNA-30a即可通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌细胞的增殖转移。Miao Y等使用免疫组化、蛋白印迹、qRT-PCR等实验方法，比较了114对乳腺癌组织与邻近正常组织中microRNA-30a和β-连环蛋白(β-catenin)的表达情况，得出microRNA-30a表达在乳腺癌组织中显著低于邻近正常组织，β-catenin蛋白表达则呈现相反状况。随后队列分析，得出乳腺癌患者的发病年龄、雌激素、孕激素和HER-2表达与microRNA-30a或β-catenin蛋白表达无关，肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期和乳腺癌患者的预后与microRNA-30a或β-catenin蛋白表达显著相关。由此，可推测microRNA-30a可作为乳腺癌预后的监测指标，且可以通过抑制β-catenin蛋白的积累，阻断Wnt/β-catenin途径，从而抑制乳腺癌的发展[13]。上皮到间质的过渡是肿瘤发展过程中的重要环节，Chang CW等发现microRNA-30a可以与Slug(间质的主要调节剂之一)mRNA的3’UTR结合来增加紧密连接蛋白的表达，从而抑制EMT[14]。这一发现，可能成为乳腺癌治疗的新方向。(3)microRNA let-7b：microRNA let-7b最初是在线虫中发现，随着分子生物学的深入研究，证实了其是人体重要的microRNA成员之一。microRNA let-7b可以靶向胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)充当骨肉瘤中的肿瘤抑制因子；microRNA let-7b通过靶向生长抑制基因1(ING1)来抑制胃癌发展[15]；HOST2在HPV阳性宫颈癌(CC)组织和细胞中上调，并通过促进 microRNA let-7b的增殖、迁移和侵袭，抑制HPV阳性CC细胞的凋亡。Li M等分析了257名乳腺癌患者及257名健康对照血浆中microRNA的表达，鉴定出一组microRNAs(microRNA let-7b-5p、microRNA-122-5p、microRNA-146b-5p、microRNA-210-3p和microRNA-215-5p)用作乳腺癌检测的生物标志物。其中microRNA let-7b-5p在组织中的表达呈下调状态，表明microRNA let-7b-5p对乳腺癌起抑制作用[16]。Wang H等的实验显示尾型同源框转录因子2(CDX2)和microRNA let-7b在乳腺癌细胞和组织中表达较差。CDX2与microRNA let-7b结合并促进microRNA let-7b的表达，相反地抑制了人胶原蛋白型(COL11A1)的表达。CDX2和microRNA let-7耗尽或COL11A1过表达会刺激癌细胞的增殖、侵袭、迁移，因此可以得出结论，CDX2可以促进microRNA let-7b表达。机制可能是通过抑制COL11A1的表达而对乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移产生抑制作用。这一发现为乳腺癌提供了一种新的治疗策略。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤浸润树突细胞(TIDC)都是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫抑制和促进癌症进展的重要组成部分。靶向这些细胞并改变其表型可能会恢复其抗肿瘤活性。Huang Z等设计实验证明，microRNA let-7b有效地重新编程了TAM / TIDC的功能，逆转了抑制性肿瘤微环境，并抑制了肿瘤的生长。(4)其他抑癌microRNA：microRNA-299-5p在乳腺癌组织和细胞中表达下调，Chenxing Li等用裸鼠做体内实验发现其过表达可以抑制裸鼠的肿瘤转移。双荧光素酶测定表明，microRNA-299-5p直接靶向丝氨酸/苏氨酸39(STK39)，从而抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，起到抑制乳腺癌的作用[17]。TNBC是最恶性的乳腺癌，Shi D等证明microRNA-153可以通过ZEB2/EMT链来抑制TNBC的增殖、迁移、侵袭，为TNBC治疗提供新思路。microRNA-151-5p在乳腺癌组织中显著下调，伤口愈合实验和迁移实验证明，microRNA-151-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，在乳腺癌中起抑癌作用[18]。M2型巨噬细胞可以产生多种细胞因子，促进恶性细胞的生长，Sánchez-González等发现microRNA-149通过限制集落刺激因子1(CSF1)和M2细胞的极化抑制乳腺癌的增殖和转移[19]。Zhang J等发现microRNA-383-5p靶向LDHA抑制乳腺癌侵袭、转移，可成为乳腺癌治疗和预后靶标。Bcl-2相关X蛋白(Bax)是人体最主要的凋亡基因，microRNA-431的过表达促进Bax的表达从而诱导细胞凋亡。另外Wang W等发现microRNA-431靶向成纤维细胞生长因子9(FGF9)也可抑制乳腺癌细胞的增殖、转移[20]。

3 总结

综上所述，相同microRNA可靶向于不同细胞因子、参与多条细胞通路，以发挥其致癌或抑癌作用。乳腺癌的发病机制复杂多样，病因目前尚未完全明了，遗传因素、环境因素、生活习惯均可能是其致病原因。大量研究表明，乳腺癌相关的microRNA在癌症患者的组织、外周血血浆甚至尿液中有着差异表达。免疫组化技术、qRT-PCR、基因敲除技术、外泌体标志蛋白等均被运用于研究microRNA与肿瘤间的联系并进一步破解其作用机制。非侵入性生物检验标志物极大地减轻了病人痛苦，除此之外，其高度敏感性使得microRNAs成为理想的新型生物标志物。不仅是早期筛查，microRNA还可作为诊断治疗及术后监测的一种新型手段。然而，我们所研究的microRNA仅是一小部分，大多数microRNA在乳腺癌中的作用还未被证实，随着实验手段的进步，microRNA调控网络将逐步清晰，不止乳腺癌，破译各种肿瘤疾病、提高病患生存率不无可能。