下调HOXA5表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响

徐修鹏 季 晶 刘 宁 李海林 路 华

胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具有多种恶性生物学表型，如恶性增殖能力强、易向周边脑组织侵袭和放化疗抵抗等[1]。近年来，尽管胶质瘤的综合治疗取得了一定程度的进展，但病人中位生存期却未明显延长，部分归因于胶质瘤的恶性增殖能力[2]。因此，探索胶质瘤恶性增殖能力的分子调控机制，有助于开发更有效的治疗措施。

同源框基因家族在进化上高度保守，参与调控胚胎发育和细胞分化[3]。同源异型盒基因A5（homeobox gene A5，HOXA5）是同源框基因家族中的一员，既往研究显示HOXA5在多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的多种恶性生物学表型密切相关[4]。本文探讨HOXA5 在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤增殖能力和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 生信分析 计算机检索中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA；http://www.cgga.org.cn）。从mRNAseq-693 和mRNAseq-325 芯片中获取HOXA5 mRNA 在低级别胶质瘤（WHO 分级Ⅱ级）和高级别胶质瘤（WHO 分级Ⅲ、Ⅳ级）中的表达及相应的病人生存信息。在高级别胶质瘤中，以HOXA5表达水平的平均值为界限，分为低表达组和高表达组，Kaplan-Meier 法分析HOXA5 表达水平与高级别胶质瘤病人预后的关系。

1.2 胶质瘤U87、U251细胞培养、转染及分组U87和U251 细胞（中国科学院细胞库）置于含10%胎牛血清DMEM中培养并传代。取对数生长期胶质瘤细胞种植于6孔板中，待细胞汇合度达到75%左右时，参考Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）说明书转染siRNAs。细胞分组两组：阴性对照组（转染siRNA-ctrl）和敲低组（转染siRNA-HOXA5）。36 h后收集细胞，提取总蛋白，验证干扰效率，并用于后续的生物学实验。

1.3 CCK-8 法检测细胞增殖率 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1 000个细胞。0、1、2、3、4 d，每个孔加入10 μl CCK-8 检测液（日本Dojin do 公司），37.3 ℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm 处吸光度值，计算细胞存活率。各组细胞设置5个副孔。

1.4 平板克隆实验检测细胞克隆集落形成能力 将胶质瘤细胞接种于直径6 cm 的培养皿中，每个皿接种300 个细胞，并加入4 ml 培养基充分混匀，放入37.3 ℃恒温培养箱中培养12 d，弃培养液，4%多聚甲醛固定2 h后用结晶紫染色。回收结晶紫染液，用清水冲洗后晾干、拍照、计数克隆数量，每组重复三次。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期 将胶质瘤细胞接种于6孔板中，每孔约40 000个细胞，培养36 h后，每孔加入1 ml 不含EDTA 的胰酶溶液消化细胞，至显微镜下细胞变圆，轻震板底约半数细胞飘起时加入2 ml 完全培养基终止消化，移液枪将细胞吹打成细胞悬液。离心后获得细胞沉淀，用PBS 洗涤一次后再次离心，弃洗涤液，加入-20 ℃冰箱预冷的75%酒精吹打混匀，固定。按照细胞周期检测试剂盒（中国联科生物公司）操作步骤，上机完成细胞周期检测，每组重复三次。

1.6 免疫印迹法检测细胞HOXA5 及周期相关蛋白的表达 根据凯基全蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白和组织蛋白，选用凯基BCA 试剂盒测定蛋白浓度，并用上样缓冲液配平。蛋白变性后，按每孔20 μl 上样，经10%SDS-PAGE 电泳后转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭2 h，加入相应一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗涤3 次后，加入二抗，室温摇床孵育2 h，洗涤3次后，加入曝光液曝光，拷贝条带，以β-actin为内参，Image J软件行灰度分析。

1.7 统计学分析 采用GraphPad软件进行分析；定量资料采用±s表示，采用单因素方差分析和t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤HOXA5 的表达CGGA 数据库分析结果显示：与低级别胶质瘤相比，高级别胶质瘤HOXA5 mRNA表达水平显著增高（P＜0.01，图1）。

图1 不同病理级别胶质瘤HOXA5表达水平比较

2.2 HOXA5 表达水平与高级别胶质预后的关系 生存分析结果显示：低表达组高级别胶质瘤病人中位生存时间较高表达组明显延长（P＜0.01，图2）。

图2 生存曲线分析HOXA5表达水平与高级别胶质瘤病人生存预后的关系

2.3 敲低HOXA5 表达对胶质瘤细胞增殖能力的影响siRNA-HOXA5 组细胞HOXA5 蛋白表达水平显著低于siRNA-ctrl 组（P＜0.01，图3）。与siRNA-ctrl组相比，siRNA-HOXA5组细胞增殖率和克隆形成能力均显著降低（P＜0.01，图3）。

图3 敲低HOXA5表达抑制胶质瘤U87和U251细胞增殖

2.4 敲低HOXA5 表达对细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响 流式细胞周期检测结果显示：siRNA-HOXA5 组细胞G0/G1 期细胞百分比较siRNActrl组显著增加（P＜0.01，图4）；而且，siRNA-HOXA5组细胞CDK4表达水平较siRNA-ctrl组显著减少（P＜0.01，图4）。

图4 敲低HOXA5表达对胶质瘤U87和U251细胞周期及周期相关蛋白表达的影响

3 讨论

本研究结果显示：胶质瘤HOXA5 呈高表达；HOXA5 高表达组高级别胶质瘤病人生存预后较低表达组要差。这表明，HOXA5在胶质瘤中可能发挥促癌作用，并有可能成为胶质瘤潜在的诊断标记物和治疗靶点。

既往研究表明，HOXA5的异常表达与多种肿瘤的发生与发展密切相关，例如，乳腺癌HOXA5 表达缺失促进乳腺癌的发生与发展[5～7]。进一步机制研究表明，乳腺癌HOXA5基因表达缺失与其启动子高度甲基化有关[8]。这些研究表明HOXA5在乳腺癌中发挥抑癌基因作用。与之相反的是，HOXA5在食管癌组织中高表达，并且高表达的HOXA5可以通过激活wnt/β-catenin信号通路促进食管癌细胞的上皮间质亚型转换[9]。这些研究结果表明，HOXA5 在食管癌中发挥促癌的作用。为了探讨HOXA5 对胶质瘤增殖能力的影响，我们使用siRNA 敲低胶质瘤细胞HOXA5的表达水平，结果显示，敲低HOXA5表达可以显著降低胶质瘤细胞体外增殖能力。

细胞周期是调控细胞增殖的基础生命进程，这一进程主要受细胞周期相关蛋白调控[10]。本研究结果显示，敲低胶质瘤细胞HOXA5 的表达，明显降低CDK4 表达水平，使胶质瘤细胞周期阻滞于G0/G1期。近期有文献报道，HOXA5可以通过激活wnt/βcatenin 信号通路促进肿瘤细胞的恶性生物学表型，包括细胞增殖和细胞周期[9]。但是，HOXA5 是否可以通过影响活wnt/β-catenin信号通路进而影响胶质瘤细胞增殖和细胞周期，有待进一步研究。

目前，引起胶质瘤HOXA5表达水平升高的机制尚不明确。已有研究表明，microRNA介导的转录后调控机制在调节HOXA5 表达中发挥重要作用。例如，microRNA-196a 可以通过抑制肺癌HOXA5 表达，进而促进肺癌细胞增殖与侵袭[11]。另有文献报道，乳腺癌中视黄酸可以通过泛素化降解c-myc，从而抑制microRNA-130a的表达，进而促进HOXA5的表达[12]。但是，胶质瘤HOXA5高表达是否是由相关microRNA表达异常引起，还需要进一步的验证。另外，有研究表明，HOXA5 基因启动子区甲基化与胃癌HOXA5 低表达有关[13]。因此，我们推测，胶质瘤高表达的HOXA5 可能与其启动子区低甲基化水平有关。

综上所述，靶向抑制胶质瘤HOXA5的表达可以显著降低胶质瘤细胞体外增殖能力，抑制CDK4 蛋白的表达，抑制细胞周期从G0/G1 期向G2/S 期转换。这提示HOXA5 在胶质瘤中发挥促进肿瘤增殖和细胞周期的作用，并有望成为胶质瘤分子靶向治疗的新靶点。