富硒油菜粉急性毒性研究及30天喂养实验

鄢鹏飞，田 瑞，王雪儿，朱于鹏，孙国根，程 超，莫开菊，汪兴平*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室(湖北民族大学)，湖北 恩施 445000；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000；4.恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000)

硒是人体所必需的一种微量元素，但其具有营养和毒性双重作用[1]，由于其毒性和营养性的作用剂量都很微量，因此对硒的摄入需要严格把控.人体摄入合适剂量的硒有许多益处，包括抗氧化、抗疲劳、对重金属中毒的解毒作用、调节人体免疫力以及防治心血管疾病和癌症等功效[2-5]；但是过量的硒摄入会对生命体造成一定的毒副作用，严重的甚至造成死亡.硒的毒性大小与其存在形式存在很大关系，一般来说有机硒的毒性要小于无机硒，消费者对于硒补充剂的选择也更偏向于有机硒，但现如今市场上的主流硒补充剂还是无机硒，因而寻找一种合适的有机硒补充剂有很好的市场前景.油菜相较于其他品种植物具有更好的富硒能力[6]，而且可很好地将无机硒转化为有机硒并富集.有研究表明，油菜中硒的主要赋存形式为蛋白质硒，王玉荣等[7]研究发现油菜籽粒中硒的主要形态是以硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸有机小分子硒化合物为主.我国的富硒油菜栽培技术也十分成熟，其具有成为优良硒补充剂的潜力，但对于富硒油菜的毒理和安全方面鲜有研究.进行富硒油菜粉在大鼠体内的急性毒性实验和30 d喂养实验，探究富硒油菜粉的急性毒性和安全性，可为其生产和应用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年的SPF级wistar大鼠，体质量150～200 g，数量60只，雌雄各半，使用大鼠专用生长维持饲料饲喂，由辽宁生长生物技术股份有限公司提供，生产许可证号为SCXK(辽)2020-0001，清洁级证书编号为210726200100476017.

1.2 主要材料

富硒油菜粉，硒含量为4 000 mg/kg，过200目筛，由恩施硒圣植物科技有限公司提供；丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(IFCC法)，天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(天门冬氨酸底物法)，尿素测定试剂盒(酶偶联监测法)，肌酐测定试剂盒(肌氨酸氧化酶法)，均购自潍坊三维生物工程集团有限公司.

1.3 主要仪器

PTX-3102型电子天平，华志(福建)电子科技有限公司；TMS-1024i型全自动生化分析仪，日本东京医疗.

1.4 方法

1.4.1 急性毒性实验设计 实验采用霍恩法，组距选取为3.160.将40只成年的SPF级wistar大鼠(雌雄各半，体质量为150～200 g)平均分为8组，编号为♀-1到♀-4，和♂-1到♂-4；适应性喂养7 d后正式实验.

将富硒油菜粉以蒸馏水配成不同浓度的悬浊液，按大鼠体质量进行灌胃给药，灌胃前对所有大鼠禁食14 h(灌胃前天晚上对其断食，14 h后的第2 d进行灌胃，灌胃结束2 h后再投放饲料)，不禁水.各组灌胃剂量见表1.灌胃结束后对大鼠进行观察，记录异常行为、进食量、体质量变化情况以及毒性表现和死亡情况，时长为14 d，对死亡大鼠进行剖检.观察期结束后处死所有大鼠并进行解剖，观察脏器状况并称湿重，用于脏器指数计算.

表1 实验分组及灌胃剂量

1.4.2 30 d喂养实验 富硒油菜粉提供企业以及目前研究所推荐的抗癌人体摄入量为5.7 μg/kg·BW(按70 kg成人体质量计算)[8]，将人的临床剂量转化为试验大鼠的剂量，为6.3·A=35.9 μg/kg·BW，为便于计算选取剂量为以硒计36 μg/kg·BW，考虑安全性采取该剂量的10倍，即实验组富硒油菜粉剂量为0.09 g/kg·BW(以硒计0.36 mg/kg·BW)，30 d内每日采取灌胃给药.在30 d的观察期中记录每日进食量，每3 d记录1次体质量，在15 d断尾取血，30 d屠宰实验心脏取血，血液离心后取血清用于血生化指标分析.观察期结束后剖检大鼠，并记录脏器湿重，用于计脏器比计算.

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验分析

2.1.1 临床实验观察 在灌胃结束30 min后，雌雄两种性别的第1组(0.316 g/kg·BW)和第2组(1.000 g/kg·BW)组大鼠的各种日常行为均无异常，精神状况良好；两种性别的第2组大鼠在第1天的采食量有少许降低，第2天恢复正常，且之后每日采食量趋于稳定.两种性别的第3组(3.160 g/kg·BW)大鼠在灌胃结束后很快就出现了精神萎靡的状况，但并不严重，其对于外界的刺激反应依旧明显，该剂量组大鼠精神状况及日常行为在第2天恢复正常，采食量较1、2组在第1天有大幅度的降低，第3天恢复正常.雌雄1、2、3组大鼠在观察期间均无死亡.

最高剂量组第4组(10.000 g/kg·BW)在灌胃达到要求剂量后，雌雄大鼠均在5 min后出现严重的精神萎靡，活动量减少，对外界刺激变得不敏感，之后还出现毛发竖立，嗜睡乏力，扎堆缩成一团，严重者甚至出现闭眼和呼吸窘迫，食欲废止.这些不良状况随时间慢慢恢复，雄性组在6 d后恢复正常，而雌性组在第1天死亡2只，观察到死亡大鼠肛门部位有黄色分泌物，鼻子处有少量血迹，剩余3只在7 d后精神和行为恢复正常，采食量在第10天恢复正常，但有一只在第15天观察到严重的腹水状况.

2.1.2 LD50的计算 依据国标GB.15193.3-2014中的霍恩表，由于死亡数量并未达到表中最低数目，可得出该富硒油菜粉在大鼠体内的LD50要大于表中最高剂量2.82 g/kg·BW，以硒计11.28 mg/kg·BW.但借鉴熊浩明[9]、周一平等[10]的方法，采用SPSS分析软件计算LD50，计算出其LD50为11.75 g/kg·BW，以硒计为47 mg/kg·BW.

2.1.3 大鼠急性染毒后进食量和体质量变化 在急性染毒完成后的14 d观察期内，各组大鼠的日均采食量和平均体质量如图1～2所示.两种性别大鼠的1、2组采食量变化不明显，除灌胃后的第1天采食量有极少的降低外，其余每天采食量趋于稳定；雌雄第3组的采食量在前3 d较低，但随时间逐步恢复；而最高剂量的第4组需要更长的恢复时间，雌性组比雄性组恢复更慢，雄性组在第6天恢复，雌性组在第10天.

(a) 雌性大鼠(b) 雄性大鼠

体质量变化与每日采食量有很大关系，两种性别的第1、2、3组的大鼠体质量每3 d都会有一定增长；雄性第4组在第1个3 d体质量有所降低，在之后的观察期中该组大鼠的体质量逐步恢复并缓慢慢增长；而雌性第4组在前9 d中体质量都呈降低趋势，之后才开始恢复.

(a) 雌性大鼠(b) 雄性大鼠

2.1.4 大鼠急性染毒后病理解剖 对急性染毒死亡的大鼠解剖发现：肝脏呈不健康的棕褐色，表面出现出血点，部分部位有黄白色坏死灶；肺部存在淤血且水肿，颜色呈不正常的暗红色；心脏颜色暗红，冠状动脉处有淤血血块；脾脏和肾脏色泽出现异常，较正常色泽偏黑.存活大鼠大体解剖发现：除雌性第4组外，其余大鼠的各类脏器均未观察到肉眼可见的病变；雌性第4组的3只存活大鼠中1只未观察到病变，1只出现严重的腹水，最后1只未出现腹水，但后2只大鼠的肝脏均出现了明显病变，肝脏表面不再光滑，出现明显的颗粒物质，其余脏器未观察到病变.

2.1.5 富硒油菜粉对大鼠脏器指数的影响 各组大鼠的脏器指数如表2所示.经过富硒油菜粉急性染毒后，随剂量增加雌雄两种性别的各组大鼠的脏器指数大致会呈现增加的趋势，但前3组组间各类脏器指数无显著性差异(P>0.05)，最高剂量组第4组各类脏器指数出现显著性差异(P<0.05)，且出现较大增长.

表2 富硒油菜粉对大鼠脏器指数的影响

2.2 30 d毒性实验分析

2.2.1 日均采食量和体质量变化 在30 d的喂养过程中，雌性对照组有1只在第7天由于灌胃操作失误造成肺部破损死亡，雄性实验组有1只于第29天由于之前断尾取血伤口处理不当，而使尾巴部伤口感染造成死亡，对其大体解剖未观察到肉眼可见病变.各组大鼠进食量和体质量如图3～4所示，两种性别的实验组和对照组采食量都大致稳定，在第16天由于断尾取血造成采食量有一定波动；两种性别大鼠实验组和对照组之间体质量变化差异并不明显.

图3 富硒油菜粉30 d喂养实验对大鼠日均采食量的影响图4 富硒油菜粉30 d喂养实验对大鼠体质量的影响

2.2.2 脏器指数与部分重要血生化指标 30 d喂养后解剖各组大鼠，各组脏器指数见表3.雄性实验组除肾脏外，其余各脏器指数均有少量升高；雌性实验组各脏器指数都少量升高.但实验组和对照组之间的所有脏器指数并无显著差异(P>0.05).

表3 30 d喂养对大鼠脏器指数的影响

雌雄组两次部分血生化指标测定结果如表4所示.两次的血生化指标结果都是雄性实验组与对照组的ALT之间存在显著性差异(P<0.05)，其他指标均不存在显著性差异(P>0.05).

表4 部分血液生化指标测定结果

3 讨论

3.1 富硒油菜粉在大鼠体内的急性毒性

大鼠在急性染毒后，低剂量的两组(0.316 g/kg·BW和1.000 g/kg·BW)日常行为和精神状况未观察到异常，第3组(3.160 g/kg·BW)在染毒后很快就表现出了精神萎靡、食欲废止等中毒行为，而最高剂量的第4组(10.000 g/kg·BW)在染毒完全后很快就出现相似的症状，且症状较第3组更为严重，恢复时间更长，甚至出现死亡，可见富硒油菜粉的急性毒性呈现出明显量效关系和性别差异，在雌性大鼠体内毒性更大.

体质量的变化可以很直观地反映出实验动物的健康情况以及中毒后的表现[11].硒作为生物体所必需的一种微量元素，在合理的摄入量下具有促进生长发育的功效，对动物的体质量增长有一定促进作用.在本次实验中，最大剂量组的第4组在短期内大量给药，其他组也分别给予一定油菜粉，因而可能在短期内使大鼠食欲有所减退，对大鼠的消化系统也可能产生一定影响，从而造成前期日均采食量的降低以及体质量的一定程度丢失.而雌性第4组，最后几天观察期间该组大鼠平均体质量异常升高，这可能是因为有大鼠出现腹水状况，造成了体质量的上升.

对死亡大鼠进行剖检观察到的状况可推断出富硒油菜粉的急性毒性的主要靶器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和脾脏.脏器指数在毒性实验评价中有着重要的地位，而结果表明，各类脏器指数与富硒油菜粉呈现明显的量效关系，随剂量的增加而上升，也反映出上述的脏器为其急性毒性的主要靶器官，而上升的原因可能是对富硒植物粉代谢而造成的脏器充血和病变.各脏器病变中最明显的是肝脏的出血点和黄白色坏死灶以及肺部的严重淤血和心脏肿大，推断出大鼠死亡原因可能是肝淤血和心肺功能紊乱造成的呼吸障碍，这一情况与文献描述一致[12].肝脏是硒代谢的主要场所，一般硒被代谢后的产物大部分会随尿液排出，少部分会随粪便、汗液或从毛发排出，但当大量的硒被摄入时，硒会被代谢为具挥发性的二甲基硒化合物而从肺部排出[13-14]，这可能是造成肺部损伤淤血进而造成大鼠死亡的原因.在存活大鼠中有出现腹水这一病征，对其解剖发现其肝脏已出现明显的病变，这可能是因为肝脏是硒代谢的主要场所，而在高剂量的硒摄入情况下，肝脏对其代谢已超出能力范围，而由于硒在体内代谢产生的各类化合物以及它们参与的各类过氧化反应会产生大量自由基，而过量的自由基可能就会对肝细胞的细胞膜造成损伤，从而造成病变[15].

油菜作为人们日常生活中重要的经济植物以及油料植物，其本身是以食物存在于人们生活中的，因而油菜本身是不会对人体造成损伤和毒性的，而采用硒栽培技术生产的富硒油菜，由于硒元素的加入，其可能会对人体产生危害.在本实验中，对中毒大鼠的毒性反应和解剖结果表明，其毒性反应以及中毒的靶器官与文献描述的硒中毒基本一致，也因而可以初步推断出富硒油菜的毒性来源于其中的硒元素[16-21].

计算所得该富硒油菜粉的LD50为11.75 g/kg·BW，以硒计为47 mg/kg·BW，依据国标GB15193.3-2014分类为实际无毒类.胡滨等[16]对亚硒酸钠在大小鼠体内的急性毒性采用改良寇氏法进行了测定，大鼠经口灌胃的LD50为11.75 mg/kg·BW，小鼠为3.86 mg/kg·BW[17].胡晓荣[18]等以霍恩法测定大鼠经口染毒亚硒酸钠的LD50为雌雄鼠分别为36.9、42.2 mg/kg·BW.Yang等[19]以霍恩法测定甲基硒半胱氨酸在大鼠中的LD50,雄鼠和雌鼠分别为9.26、12.6 mg/kg·BW.于英杰[20]对硒含量为1 000 mg/kg的富硒酵母进行安全性评价，发现小鼠口服的LD50为26.38 g/kg·BW(以硒计为26.38 mg/kg·BW).Zhang等[21]测定红色元素纳米硒在小鼠体内的LD50为113 mg/kg·BW.可以看出硒及其化合物毒性的大小与其赋存形式有很大关系.本实验的实验材料为富硒油菜粉，其主要的硒形态为有机形式的蛋白质硒[22]，以其作为硒补充剂，其安全性要高于以亚硒酸钠为代表的无机硒和甲基硒半胱氨酸这类有机硒，毒性也小于同为富硒产品的富硒酵母，这可能与鼠种、实验方法和其在体内的吸收和代谢有关；而其安全性小于纳米硒，但考虑生产成本，它相较于纳米硒更适合硒补充剂产品市场.富硒油菜粉表现出性别的毒性差异，其在雌性体内的毒性要大于雄性，这一点与胡晓荣[18]等报道的亚硒酸钠的急性毒性一致.

3.2 富硒油菜粉对大鼠30 d喂养实验的影响

富硒油菜粉对大鼠的30 d饲喂实验中，在0.09 g/kg·BW(以硒计为360 μg/kg·BW)的剂量下，两种性别的大鼠与对照组相比，在观察期内均无不良反应，饮食状况、体质量变化以及日常活动均表现正常.在该剂量下，对大鼠无明显毒害作用.

实验组大鼠与对照组相比各类脏器指数有少许升高但并无显著性差异(P>0.05)，这可能是硒的代谢而造成各脏器充血更活跃.肝脏和肾脏是硒在体内主要的代谢场所，而谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)可以反映肝功能好坏的重要指标[23-24]，尿素(Urea)和肌酐(CRE)是反映肾功能好坏的重要指标[25-26].而这几个指标除雄性组的ALT存在显著性差异(P<0.05)外，其余各项均不存在显著性差异(P>0.05)，这可能是因为肝脏是其主要的代谢场所，而ALT的升高是因为硒的代谢造成其肝脏功能更加活跃，但其他血生化指标数据又说明该剂量下硒在机体内的代谢是在机内所能承受的范围内的.

4 结论

采取霍恩法对富硒油菜粉进行急性毒性实验，计算其LD50为11.75 g/kg·BW，以硒计为47 mg/kg·BW，毒性主要靶器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和脾脏，其毒性要小于亚硒酸钠和甲基硒半胱氨酸，具有成为优质硒补充剂的潜力；通过30 d喂养预实验，初步验证了在人体推荐最大摄入量(400 μg/d)的10倍剂量下，并不会对大鼠的机体代谢产生过大的负担而造成毒害作用.为后续富硒油菜粉的遗传毒性和亚慢性毒性实验设计提供数据支撑，也丰富了硒的毒理学资料，对硒的毒理学研究、硒补充剂的生产和人体合理补充硒有一定指导作用.