GJB2基因突变引起耳蜗功能改变的机制*

于一丁 赵雪雷 文铖 李悦 于宁 黄丽辉

GJB2基因是最常见耳聋基因，主要编码的缝隙连接蛋白26(connexin26，Cx26)是耳蜗中最重要的一种缝隙连接蛋白；缝隙连接系统在维持耳蜗内的正常钾循环及微环境中起重要作用。GJB2基因是耳蜗中表达最强的一种连接蛋白，参与构成耳蜗中的缝隙连接(gap junction，GJ)系统，对于维持内耳微环境及细胞间的协调稳定具有重要作用。该基因突变引起的听力损失并非全部为先天性，相当部分患者于儿童期出现迟发性进行性听力损失，且程度及类型不同，无法单纯以同一致病机制解释[1]。GJB2基因突变后常导致多种不同类型及程度的听力损失，其突变相关先天性耳聋可能由耳蜗发育障碍导致，而迟发性听力损失则可能与耳蜗功能改变相关。

临床上较少有针对GJB2基因突变患者耳蜗功能改变的相关研究，如耳蜗电位的改变情况，本文仅对GJB2突变造成的耳蜗电位及主动放大功能改变造成迟发性听力损失的致病机制进行综述，为GJB2基因突变精确诊断及治疗提供参考。

1 GJB2基因突变通过钾离子循环障碍影响耳蜗功能

1.1GJB2基因维持耳蜗内钾循环作用 GJB2基因主要表达Cx26，与其他缝隙连接蛋白构成耳蜗内的缝隙连接系统，参与维持耳蜗中各种离子等物质的动态平衡，对耳蜗正常功能发挥着重要的生理作用。耳蜗结构复杂，主要由三个充满液体的腔室组成，即前庭阶、中阶和鼓阶,中阶内充满内淋巴，含有较高的钾离子及较低的钠离子。钾循环学说认为，当声音刺激毛细胞时，纤毛上的非选择性阳离子通道开启，内淋巴中的钙离子、钾离子等进入毛细胞内，随后通过毛细胞底侧壁的钙离子依赖性钾通道开启，将钾离子排入组织间隙，后经支持细胞吸收后再次循环至内淋巴中，缝隙连接被认为在此过程中起关键作用，协助维持耳蜗内淋巴的高钾状态[2,3]。缝隙连接参与钾离子回收、供应营养物质和能量、传递细胞间信号及维持内外淋巴液微环境等，Cx26形成的通道和半通道在通透性方面有很强的电荷选择性，主要与阴离子的通透性相关，包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)等信号分子，在耳蜗细胞间信号传递及营养和能量供给中具有重要意义[4]。研究表明，ATP作为重要信号分子，参与引起支持细胞钾依赖性内向电流，协助支持细胞回收钾循环中的钾离子维持钾循环正常功能[5]。GJB2基因突变可通过两种方式影响耳蜗内ATP释放，一是GJB2基因突变后的缝隙连接通道对ATP的通透性下降[4]；二是Cx26单独形成半通道直接参与释放ATP等物质，调节耳蜗功能[5]。Forge等[6]发现，GJB2基因突变后钾循环受到影响，内淋巴钾离子平衡状态遭到破坏；Lin等[7]将GJB2基因p.V37I位点变异敲入小鼠，小鼠出现轻度听力损失，认为是鼓室注射钾离子后导致其清除速率降低，钾循环障碍，引起钾离子蓄积。综上所述，Cx26对于维持耳蜗内正常钾循环发挥着重要的作用。

1.2钾循环与耳蜗蜗内直流电位(endocochlear potential，EP)的维持 1958年，David提出了耳蜗电生理的“电源学说”，血管纹基底膜细胞上的钾离子通道KCNJ10与边缘细胞共同维持中阶内淋巴中的EP[8]。EP由耳蜗内正常的钾离子循环及代谢保持，正常耳蜗毛细胞内的静息电位值大约为-60 mV，耳蜗内电位与其形成在耳蜗毛细胞纤毛的内外侧绝对电位差约为+140 mV，构成耳蜗内所有生物电及声-电转换功能主要驱动力，即“电源”。内淋巴中高钾环境主要来自于血管纹中多种细胞的协同作用，并由支持细胞和毛细胞等共同参与的钾循环维持[3]；钾循环对于维持内外淋巴液之间钾离子浓度差至关重要，钾循环障碍时EP可出现改变，EP实际上是钾离子的平衡电位[9]，正常耳蜗功能与耳蜗中钾离子循环密切相关。

1.3EP降低导致耳蜗电位改变 耳蜗电位包括耳蜗微音电位(cochlea microphonics,CM)、总和电位(summating potential,SP)、复合动作电位(compound action potiential,CAP)，分别反映外毛细胞功能、内毛细胞功能状态及耳蜗传入通路功能状态。当钾循环障碍时，EP下降，耳蜗“电源”关闭，毛细胞表皮板两侧的电势差降低，导致各项耳蜗内电活动出现问题，直接引起外毛细胞功能下降及CM、SP、CAP等耳蜗电位改变。Wang等[10,11]采用静脉注射速尿干扰钾循环正常功能，发现耳蜗电位对EP有很强的依赖性，EP下降时，CM振幅下降、CAP阈值提高，耳蜗电位与EP具有很强的相关性。李兴启等[12]和孙伟等[13]使用同一电极在中阶同时记录豚鼠缺氧状态下EP和SP、CAP的改变情况，发现EP下降后SP由正值变为负值，SP/EP成比例变化，CAP阈值上升；Jacob等[14]发现EP可直接影响Corti器几何形态，不同EP下耳蜗Hensen细胞和毛细胞位置改变，支持细胞通过向外毛细胞施加不同的机械负载调节外毛细胞形态影响其能动性，也可能会造成耳蜗电位改变。以上研究说明钾循环障碍引起EP的降低可以引起耳蜗电位改变。

1.4钾循环障碍引起耳蜗其他微环境改变 耳蜗微环境对于维持耳蜗正常功能至关重要，其稳定主要由钾循环、钙循环及谷氨酸-谷氨酰胺循环共同维持[15]。耳蜗毛细胞顶部纤毛处于中阶的内淋巴中，合适的微环境对于发挥外毛细胞正常的生理功能具有重要意义。在离体外毛细胞的能动性研究中，钾离子的浓度变化可以直接引起外毛细胞运动，高钾离子可引起细胞膜去极化，使胞内钙离子浓度升高，外毛细胞出现收缩[16]；Marcon等[17]使用含有不同浓度钾离子的细胞外液注射至豚鼠鼓室，记录其畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission, DPOAE)变化，发现钾离子浓度升高可导致DPOAE幅度下降，外毛细胞能动性改变。

耳蜗内钾循环障碍可同时影响钙循环及谷氨酸-谷氨酰胺循环。在内外淋巴液中，钙离子在内外淋巴液中浓度相差10～100倍，EP作为耳蜗内各项电位的“电源”，参与维持内外淋巴液中正常钙离子浓度差。Hakuba等[18]在沙鼠耳蜗缺血模型中发现，阻断双侧椎动脉造成耳蜗短暂缺血可以出现CAP阈值升高及内淋巴液中谷氨酸浓度升高。推测缺血造成的钾循环障碍引起的钾浓度升高可导致支持细胞上谷氨酰胺转运载体功能紊乱，导致谷氨酸蓄积，造成耳蜗传入通路障碍，谷氨酸增多后过度激活毛细胞钙离子通道引起钙离子内流，导致钙超载；胞内钙离子浓度增加又引起钙依赖型钾离子通道开放，使细胞膜超极化，直接引起膜电位改变并降低外毛细胞功能[19]。同时，GJB2基因突变可导致Cx26的半通道功能出现障碍，影响其释放ATP、一氧化氮(NO)等信号因子，可进一步引起钙离子失调，失调的钙离子通过改变外毛细胞骨架的强度或电压敏感性等机制降低外毛细胞的能动性[20,21]。

2 GJB2基因突变直接导致耳蜗主动放大作用障碍

GJB2基因突变还可通过直接导致耳蜗主动放大作用障碍造成耳蜗功能下降[22～25]。在耳蜗支持细胞中，Cx26与Cx30为最主要的缝隙连接蛋白，参与维持耳蜗中钾循环等正常生理功能；两种缝隙连接蛋白在耳蜗内的分布既有差异又有重叠，Deiters细胞及柱细胞胞体均分布大量Cx26及Cx30，可共同形成杂合型缝隙连接通道[7]；而Hensens细胞上则主要分布Cx26[26]。Cx30敲除小鼠的EP降低且与听力损失程度一致，全聋时EP消失，说明EP下降是Cx30 敲除小鼠的主要致聋机制[27]。而Cx26敲除小鼠EP降低程度与耳聋下降程度并非完全相关，小鼠敲除Cx26后全聋时，EP仍可保持较高水平，因此有观点认为EP下降并非完全是GJB2基因突变的致病机制[23]。

GJB2基因突变小鼠听力下降程度与EP下降程度并不成正比，甚至部分小鼠EP并未发生改变，故认为GJB2基因突变直接导致耳蜗主动放大功能障碍才是耳蜗功能下降的核心。近年来发现，在小鼠出生5天后敲除Cx26，小鼠出现了类似于临床的迟发性听力损失，即高频开始的轻至中度进行性听力下降[24,25]；基因突变小鼠的耳蜗发育正常，无明显毛细胞丢失，但DPOAE降低，EP降低程度与听力减退程度并不直接相关，故认为GJB2基因突变引起的迟发性听力损失程度与EP下降并不完全相关，EP改变不是耳蜗功能下降的主要原因。Zong等[24]研究发现耳蜗主动放大功能的受损程度逐渐加重，听力损失逐渐从高频扩展到低频，损伤程度也不同。Zhu等[25]发现将耳蜗Deiters细胞与外柱细胞中的Cx26敲除后，小鼠出现进行性听力下降伴DPOAE幅值降低，而EP几乎没有改变；Chen等[23]发现出生10天后敲除Cx26的小鼠表现为迟发性进行性听力下降，且听力下降水平与EP降低水平无关，但外毛细胞的非线性电容在去极化方向上向右移动，电压依赖性的斜率减小，说明耳蜗外毛细胞功能改变，主动放大功能降低。以上研究说明，GJB2基因突变可直接导致耳蜗主动放大功能障碍。

3 小结

GJB2基因突变可导致不同程度及类型的听力下降，Cx26构成的缝隙连接系统在维持耳蜗内的正常钾循环及微环境中起重要作用。动物实验发现，发育早期敲除Cx26可导致耳蜗发育障碍，Cx26构成的缝隙连接还可能与葡萄糖、ATP、miRNA等大分子通透性有关，该基因突变造成耳蜗发育期的细胞骨架及营养障碍，Corti器隧道无法打开，说明GJB2基因突变所导致的先天性耳聋致病机制为耳蜗发育障碍[23,28]。而该基因突变导致的迟发性听力损失则可以用耳蜗功能改变进行解释，突变通过影响钾循环造成EP下降，EP作为耳蜗内电活动的“电源”，直接或间接影响CM、SP、CAP等耳蜗电位；EP本质上是钾离子的平衡电位，钾循环障碍后钙循环、谷氨酸-谷氨酰胺循环均受到影响，耳蜗微环境成分发生改变，而处于其中的外毛细胞功能可能受到影响；EP还可通过影响Corti器形态导致外毛细胞主动放大功能降低。但近年研究观点认为，突变导致的EP降低可能并非导致迟发性听力损失出现的主要原因，而应该是耳蜗外毛细胞主动放大功能障碍，其具体的机制仍需进一步研究。

(致谢：衷心感谢解放军总医院耳鼻咽喉科研究所李兴启教授对本文的悉心指导。)