Usher综合征的分子遗传学研究及治疗进展

王肃旸 刘晓雯 郭玉芬,3

Usher综合征(Usher syndrome, USH)又称遗传性聋-视网膜色素变性综合征，是以感音神经性聋和渐进性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)为主要临床表现的一种常染色体隐性遗传性疾病，主要影响听觉、视觉和平衡觉。据估计全球约有40万患者，普通人群中USH发病率约为3/100 000～6.2/100 000,占所有先天性聋的5%及RP病例的18%。Usher综合征具有临床异质性和遗传异质性，分为三种不同的临床亚型，与多个基因位点相关。Usher基因编码多种蛋白质，这些蛋白质在内耳和视网膜中表达，在感觉毛细胞发育和功能以及光感受器维持方面发挥重要功能。虽然许多治疗相关的研究前景可观，然而临床上尚缺乏对其公认有效的治疗手段。

1 Usher综合征遗传学

目前已鉴定出USH至少10个致病基因，包括6个USH1基因、3个USH2基因和1个USH3基因。在USH家系中，NGS的诊断率可达到70%～80%左右。最新的一项Meta分析纳入了11项研究报告[1]，684名USH患者，91%(624/684)的患者通过鉴定USH基因的双等位致病突变进行了分子诊断。对每个USH基因的双等位基因致病突变率进行评估，按致病频率分类依次为：USH2A：50%(341/684)，MYO7A：21%(144/684)，CDH23：6%(39/684)，ADGRV1：5%(35/684)，PCDH15：3%(21/684)，USH1C：2%(17/684)，CLRN1：2%(14/684)，USH1G：1%(9/684)，WHRN：0.4%(3/684)，PDZD:70.1%(1/684)，CIB2:0(0/684)。按照临床亚型的频率分别为：①USHI：33.6%(230/684)；②USH2：55.6%(380/684)；③USH3：1%(14/684)；④USH基因未发现致病突变：8.8%(60/684)。

USH基因编码的蛋白具有多种结构和功能作用，包括肌球蛋白VII a(myosin VIIA:USH1B)，细胞粘附分子(cadherin 23:USH1D; protocadherin 15:USH1F; usherin:USH2A)，支架蛋白(harmonin:USH1C; sans:USH1G; whirlin: USH2D)，G蛋白偶联受体(ADGRV1: USH2C)，钙整合素结合蛋白(CIB2: USH1J)和跨膜蛋白(clarin-1: USH3A)。当这些基因在耳蜗、椭圆囊、球囊和三个半规管的毛细胞以及视网膜光感受器细胞上高表达，参与了凝聚、机械转导、突触配对以及蛋白质和细胞器运输等一系列过程，将导致耳聋(伴有或不伴有平衡功能下降)和失明。USH分为3型:Usher Ⅰ型、UsherⅡ型、UsherⅢ型。

1.1Usher I型 Usher I型(USH1)是最严重的亚型，主要表现为先天性严重的耳聋及前庭功能异常，夜盲的症状出现得较USH2患者早,约占所有Usher综合征病例的25%～44%(Reiners等，2006)。大部分患儿听力损失较重，不能通过新生儿听力筛查。前庭反射表现为运动发育迟缓，通常在18个月前不能独立行走。他们会通过视觉来补偿前庭反射，直到RP发作，但在需要保持平衡的的活动中(比如骑自行车)更容易摔倒。这类患儿往往需要早期植入人工耳蜗帮助他们回归主流社会。

目前已知的与USH1相关的基因有9个(USH1B-J)，已鉴定6个基因：MYO7A(USH1B)，USH1C(USH1C)，CDH23(USH1D)，PCDH15(USH1F)，USH1G(USH1G)和CIB2(USH1J)。半数以上USH1病例由MYO7A所致。USH1E、USH1H和USH1K基因座已分别定位于染色体21q21、15q22-23和10p11.21-q21.1，但尚未确定。

1.2UsherⅡ型 UsherⅡ型(USH2)发病率最高，约占70%(Reiners等，2006)，主要表现为先天性非进行性中至重度感音神经性聋，前庭功能正常，青春期或之后发生双眼RP；听力损失的典型特征表现为下降型曲线[2]。由于听力损失为先天性，也难以通过新生儿听力筛查，若没有行听力筛查，高频听力损失在10岁左右才被诊断[3]。但有报道USH2A患者听力损失逐年加重(Sadeghi等，2004)。大部分患儿配戴助听器可与人正常交流，约10%的USH 2A型患者植入了人工耳蜗。USH2患者前庭功能正常，但有眩晕发作的报道[4]，因此在后期研究中应当关注前庭系统的亚临床变化。USH2的三个基因被鉴定为USH2A(USH2A)、ADGRV1(USH2C)和WHRN(USH2D)。USH2A突变是USH的最常见原因，约占USH2病例的80%[5]。

1.3Usher Ⅲ型 Usher Ⅲ型(USH3)主要表现为语后进行性双侧对称性感音神经性聋，前庭功能可能出现下降，或伴有20岁以前出现的RP。该型主要在芬兰和德系犹太人中流行(Ness等，2003)，大多数人群中很少见，约占所有病例的2%～4%。该型听力及前庭特征等临床表型变异最大，听力损失主要表现为语后进行性双侧对称性感音神经性聋,听力图通常显示高频听力损失或中高频损失为主。大多数患者于16个月左右可独立行走，约一半的患者存在前庭功能异常(Sadeghi等，2005), RP发生时间和程度表现各异。CLRN1(USH3A)是目前唯一被证实导致USH3的基因，有两个先天突变，p(Tyr176*)和p.*Asn48Lys，分别在芬兰[8]和德系犹太人群(Rr Fields等，2002)中检出。此外，在两名表型与USH3相关的患者中发现了组氨酰-tRNA合成酶(HARS)的纯合子错义变体(histidyl-tRNA synthetase，HARS)[6]。

近年来有学者将在临床表型上相似但与上述三种类型不能匹配的非典型USH归类为一个新的亚型，即USH4型[7]。

2 基因型-表型相关性

Usher基因显示出巨大的临床异质性，大多数Usher基因的不同突变与常染色体隐性遗传性RP或常染色体显性或隐性感音神经性聋(DFNA或DFNB)的非综合征病例有关，例如MYO7A突变，它与显性和隐性非综合征型听力损失有关(分别为DFNA11[OMIM#601317]和DFNB2[OMIM#600060])。导致DFNB2的MYO7A突变与引起USH1的突变相似，这种表型是由缺失的RP引起的，还是可能存在影响表型的修饰因素？有报道MYO7A突变导致中国人群USH1和USH2单侧听神经病的表型，扩大了USH的表型谱。在其他USH1基因中，CDH23和PCDH15均存在基因型-表型相关性；错义突变主要与非综合征型聋(DFNB12[OMIM#601386]或DFNB23[OMIM#609533])或更轻微的RP症状有关，而移码、无义和剪接位点突变会导致USH1。

USH2A有多种突变谱，包括无义突变、移码突变、错义突变和剪接突变，以及缺失和重复。在USH2A中发现的最常见的突变是外显子13 c.2299delG p.(Glu767Serfs*21)的单碱基对缺失，这已被证明与外显子剪接有关[8]。USH2A的突变与23%的非综合征型RP病例有关，在这些患者和家系中特定的突变等位基因更常见，最常见的是错义变体c.2276G>T p(Cys759Phe)。Lenassi等[9]报道了一个罕见家系，一名非综合征型听力损失患者被检出USH2A复合杂合突变——c.1036A>C p.(Asn346His)和c.13316C>T p.(Thr4439Ile)，但是他的兄弟姐妹携带相同的突变，并被诊断为典型的USH2。

到目前为止，已经报道了数项USH2A表型相关研究。Lenassi等[10]对USH2A相关RP患者进行的一项调查报告了几个在USH2家族中很少发现的“视网膜疾病特异性”等位基因，大多是危害较小的错义变异，而Usher相关变异大多包括那些被预测不会产生活性蛋白质的基因(例如，那些导致过早截断的基因)。他们提出了一个等位基因层次模型，USH2A相关视网膜病变患者中，至少有一个视网膜疾病特异性等位基因的存在。虽然没有得到后续研究的支持，但对不同的队列研究分析发现，等位基因层次模型在86%的非综合征型USH2A——RP个体中是有效的。此外，据报道，与普通的USH2患者相比，携带p.(Cys759Phe)等位基因的USH2A患者出现RP的时间更晚，听力损失也更轻[4]，而p.(Cys759Phe)变异的纯合突变或与其他USH2A的复合杂合突变与孤立性RP/RP伴发迟发性听力损失相关。相比之下，p.(Glu767Serfs*21)变异导致病情进展迅速，预后不良，需要动态的听力学监测并考虑早期人工耳蜗植入[11]。一般来说，严重的听力障碍与USH2A基因的截断突变有关。对USH2A基因型-表型相关性的进一步研究表明，该基因N端层粘连蛋白结构域存在两个截断突变或两个错义变异与USH 2患者相关，而与非综合征型RP患者无关，且至少一个截断突变的存在与早期视力下降有关，而与表型无关[12]。

1999年，Adato等在一个非近亲的犹太也门裔家庭中发现2例患者具有不同的临床表型，其中1例患者表现为USH1的临床表型，另外一例患者表现为USH3的临床表型。作者在此后的研究中发现，在同一家系中出现不同的临床表型是由于USH1表型的患者携带MYO7A的复合杂合变异，而携带USH3单倍型的纯合变异的患者表现为USH3的表型。Ness等(2003)也在40例患有USH的德系犹太人群中发现，16例临床分类为III型USH的患者，虽然所有患者均为CLRN1基因变异所致，但N48K纯合子表现出更为严重的临床表型，听力学表现尤为突出，发病年龄从婴儿期到35岁以上不等。Aller等(2004)在西班牙USH3家系中的患者也表现出语前双侧对称性重度进行性感音神经性聋(6岁：平均听阈70 dB HL；17岁：平均听阈>90 dB HL)。这些结果表明，临床上USH3与USH1或USH2可能存在混淆；另一方面，由于出现迟发性和进行性听力损失，临床上发现与USH3相符的一些患者携带USH2A、USH1B和USH1D变异。因此，根据结果和文献回顾，进行性感音神经聋和语后聋并不是诊断和鉴别USH3的重要标准。随着病例资料的逐步增多，USH3临床表型出现更多的表现形式，相比较于临床表型对USH的诊断，基因诊断更为明确和可靠。

3 USH治疗的进展

3.1临床前研究 Usher相关的RP和其他视网膜疾病(IRD)的治疗还没有非常有效的方法，许多治疗策略正在临床前期或临床Ⅰ/Ⅱa研究阶段，其中包括基因替代、基因编辑、蛋白抑制和基于反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide ASO)的方法。绝大多数USH的治疗研究都是使用患者来源的细胞(通常是成纤维细胞)或突变小鼠进行的，但是大部分小鼠模型仅表现出感音神经性听力损失和前庭功能障碍表型，只有少数小鼠模型表现出进行性视网膜变性。

3.1.1基因置换 基因置换在几种Usher小鼠模型中有效：腺相关病毒(AAV)载体已经通过视网膜下注射在Myo7a、Whrn131和Clrn1134基因敲除小鼠体内，以恢复在每种模型中存在缺陷的Usher基因的表达，双重叠AAV载体也已经作为一种潜在更安全的大基因替代载体进行了测试，取得了良好的效果。慢病毒载体的运载能力更强，却存在插入突变的风险，通过慢病毒载体向USH1B小鼠模型视网膜运送功能性Myo7a获得成功[13]。在USH1C、USH1G、USH2D和USH3小鼠模型中，通过小鼠的圆窗膜或后半规管向内耳注射AAV载体也显著改善了小鼠的内耳毛细胞功能。

小鼠的内耳在出生时尚不成熟，出生后会继续发育，大概在出生后12天惊吓反应阳性，这为基因疗法的有效干预提供了机会窗口。相比之下，人类的听力在孕19周始出现惊吓反应，出生时完全成熟。USH1为先天性听力损失，在孕前或者孕0～18周进行一级预防是否有效仍需进一步研究。

3.1.2基因编辑 另一种治疗方法是基因编辑，包括核酸酶来消除基因突变，与包含野生型序列的DNA模板进行同源重组来纠正DNA错误，用于纠正点突变、小插入/缺失和剪接点突变。近年来，CRISPR/Cas9系统因其高效和易于使用而在基因编辑中广受欢迎。该技术已成功地用于USH2A患者成纤维细胞突变修复以及患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)，包括USH2A(Glu767Serfs*21)纯合突变或(Glu767Serfs*21)/(Cys759Phe)复合杂合突变[14]。两项研究都没有报道脱靶效应,在成纤维细胞中，突变矫正率仅为2.5%，而在iPSCs中，突变矫正率高达3%。因此确保效应器官的靶点效应和高水平的编辑效率将是未来研究的关键。

3.1.3蛋白抑制 Alagramam等[15]通过高通量筛选发现另一种小分子——BioFocus 844(BF844)，经腹腔注射到USH3敲入小鼠模型时，能够稳定CLRN1 p.(Asn48Lys)错义突变产生的有缺陷的Clarin1蛋白，从而防止进行性听力损失。

3.1.4基于反义寡核苷酸(ASO)的方法 另一种治疗方法是使用ASO，这是一种短的人工修饰核酸，它通过互补碱基配对与RNA结合。ASO可以被设计成与剪接增强子或沉默靶部位的前mRNA结合，阻止或促进剪接体的结合，从而调节前mRNA的剪接。已经用ASOs治疗USH1c敲入小鼠的听力和前庭缺陷，这种小鼠具有隐蔽的剪接位点突变，导致蛋白被截断。Depreux等[16]通过新生小鼠的腹膜注射ASOs部分纠正了突变的USH1c转录本的前mRNA剪接缺陷；在同一实验中，还将ASOs注射到羊膜腔内给USH1c敲入胎鼠，并观察到出生后小鼠的前庭功能和听力的部分纠正；Wang等[17]在胎鼠第13～13.5天将ASO经羊膜腔直接注射到内耳，可纠正Harmonin RNA剪接，恢复感觉毛细胞束中Harmonin蛋白的表达，防止毛细胞丢失，提高听觉敏感度，并改善前庭功能障碍,听力和前庭功能的改善一直持续到成年。ASOs还被用于纠正USH2A基因深度内含子突变(C.7595-2144A>G)导致的剪接缺陷，该突变导致在患者来源的成纤维细胞和微基因剪接试验中插入伪外显子(PE40)。

总体而言，在针对Usher亚型的治疗方面，近年来涌现了许多前景光明的治疗策略。

3.2临床试验 基于临床前研究的成功，目前已有数项针对Usher相关性RP患者临床试验。在Usher特异性基因治疗方面，第一个临床试验评估视网膜下注射基于马传染性贫血病毒(EIAV)的重组慢病毒载体(UshStat)治疗MYO7A相关USH1(NCT01505062)的效果[13]。但是，由于审查临床开发计划和优先事项，赞助商赛诺菲已经终止了这项I/IIA期试验。另一项临床试验正在准备中，使用双杂交AAV载体将MYO7A运送到USH1B患者的视网膜(https://cordis.europa.eu/project/id/754848/it)。考虑到FDA和欧洲药品管理局(European Medicines Agency)已经批准Spark Treeutics Luxturna基因疗法用于RPE65相关视网膜疾病患者，基因替代疗法将成为未来更有可能用于治疗几种Usher亚型的选择。然而，其缺点是价格昂贵，而且传统的病毒方法不适合像USH2A这样的非常大的基因(cDNA长度>15 kb)。

在RP的治疗中，杆源性视锥细胞存活因子(RdCVF)的病毒传递也在研究中；RdCVF是一种由视杆细胞自然分泌的保护视锥感光细胞的因子，已被发现在病毒介导的视网膜表达后促进RP小鼠模型的光感受器存活。如果该方法对人类有效，可能适用于大量未经分子诊断的IRD患者。

Usher综合征和其他IRDs的治疗方法的选择与疾病的分期息息相关。现有的治疗方法可能只有在视网膜光感受器未受损的阶段才有效。在视网膜变性的晚期，细胞替代疗法或视网膜假体可能是最可行的选择。胚胎干细胞和iPSC技术的进步使细胞移植成为晚期视网膜疾病患者的希望[18]。作为干细胞眼科治疗研究的一部分，骨髓来源干细胞(BMSC)已经在5名患有不同亚型的Usher综合征的未分型患者身上进行了试验[19]。治疗前平均视敏度0.635 LogMAR，术后平均提高0.18 LogMAR。Xu等[20]研究发现 Clarin1仅限于视网膜Müller胶质细胞，在小鼠视网膜中，已发现内源性骨髓来源干细胞(BMSC)在损伤后迁移并与Müller胶质细胞融合，由此产生的杂交细胞被发现有助于替换受损的神经元，显示了哺乳动物视网膜中BMSC的再生潜力。

虽然目前还没有针对Usher特异性听力损失的临床试验，但有一项临床试验表明，含有人无性转录因子(Atoh1)cDNA的重组腺病毒5(Ad5)载体迷路注射可治疗重度至极重度感音神经性聋患者(NCT02132130),研究结果尚未公布。几个Usher小鼠突变体的成功临床前工作使基因治疗成为炙手可热的研究方向；然而，这些治疗是在小鼠内耳仍在发育的情况下进行的，对USH儿童或成人是否有效仍尚未定论。

4 结论

Usher综合征是一种具有广泛的临床和遗传异质性的疾病，通常会导致严重的听觉和视觉双重感觉丧失，对患者的生活质量造成极大的影响。近些年由于分子遗传学的发展，对USH的诊断和病因研究取得了很大的进展，但是，对于USH引起的视力下降、听力损失和前庭功能损伤并未有效的预防措施和阻止手段，因此，对患者进一步临床分型并预测预后显得尤为重要，这将为后期的遗传咨询、人工耳蜗植入前诊断提供有效信息。