山羊GDF9-L61L变异位点检测及其遗传效应分析

毕 谊，康雨欣，何礼邦，潘传英，朱海鲸，屈 雷，蓝贤勇*

(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100; 2. 陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，生命科学学院，榆林学院，陕西 榆林 719000；3. 陕西浩丽绒山羊科技发展有限公司，陕西 榆林 719000；4. 陕西省四主体一联合肉羊工程技术校企联合研究中心，陕西 榆林 719318)

目前，中国山羊产业面临着许多挑战，如优良种畜缺乏、饲料资源缺乏等。其中，群体生产性能差等问题显著影响产业经济效益。因此，深入研究影响山羊经济性状的遗传因素是十分必要的[1-2]。陕北白绒山羊具有耐寒、耐粗饲、抗病力强等特点，是陕西省数量最多、经济价值较高的山羊品种，但其在体型及产肉性能方面仍有待提高[1]。

生长分化因子9(Growthdifferentiationfactor9,GDF9)基因是生长分化因子β(TGF-β)超家族的特殊成员之一[3-5]，除在卵巢中最高表达外，广泛表达于垂体、下丘脑和子宫等20多个组织，这表明该基因可以差异地影响某些生理途径、代谢和表型表达[6-7]。同时，GDF9基因作为卵巢内的调节剂，在早期卵泡的形成中发挥重要作用，并在山羊卵泡发育全阶段均稳定表达[8]。有研究表明，在山羊离体前卵泡的长期培养过程中，GDF9和FSH可维持卵泡的完整性并能促进原始卵泡的活化和完整性[9]，以上研究均表明GDF9能够作为一个高繁殖力候选基因应用于山羊育种工作。目前，在该基因上检测到的40余个单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)突变位点已在全球30多个山羊品种上广泛研究[10]，并发现GDF9基因多态性不仅能够影响山羊繁殖性能，也与生长密切相关[11-13]，但目前有关山羊GDF9基因多态性与生长性状的研究较少。2019年，山羊GDF9基因上的两个强连锁SNP位点Q320P和V397I在山羊大群体中被发现能稳定且显著地影响山羊产羔数[12]。随后，发现GDF9-L61L位点与该基因的两个强连锁且能显著影响山羊产羔数的位点Q320P和V397I，接近强连锁关系[11]。由此提出假设：是否GDF9-L61L位点也同样能显著影响山羊的产羔呢？考虑到产羔与生长间具有一定关联，那GDF9-L61L是否也与山羊生长性状间存在显著关联呢？因此，本研究选用陕北白绒山羊为研究对象，拟鉴定位于山羊GDF9基因上的突变位点L61L，并分析其与产羔性状和山羊生长性状间的关联性，以期为后续山羊分子标记辅助选择育种提供更多有效的分子标记，加快优良生长性能山羊群体的培育速度。

1 材料与方法

1.1 样品采集及DNA提取

从陕西省榆林市选取健康的陕北白绒山羊母羊共371头，采集其耳组织样。各山羊均处于相同的生长环境并饲喂相同日粮。用剪耳钳剪取试验羊约3 g耳组织样，放入含有1 mL体积的70%乙醇的1.5 mL离心管里，暂时保存于冰盒里带回，提取DNA过程参照Wang等[14]。采样过程中，采集山羊产羔数据及其体尺数据，其中包括体高、十字部高、体长、胸围、管围、胸深、胸宽及髋[15]。

1.2 PCR扩增及基因分型

根据NCBI数据上山羊GDF9基因的序列信息(GenBank序列号：NC_030814.1)，利用实验室前期发表文章中已有的引物扩增目的片段[10]，其序列为：F: 5'-TTTGGTTTTGCTGCTTTGCCT-3'; R: 5'-TCTTTCTTCTTCCCTCCACCCA-3'。目的片段长度为409 bp。PCR扩增体系(25 μL)包括1 μL的基因组DNA模版 (10 ng/ μL),上下游引物各0.5 μL, 2 × Mix (擎科，西安) 12.5 μL，其余用ddH2O补足。

目的片段扩增利用降落PCR(Touch-down PCR)程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；68-50 ℃退火30 s(每个循环递减1 ℃)，72 ℃延伸30 s，共18个循环；然后94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。其中，每个个体进行2个重复实验，扩增产物利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，2个重复均能扩增出目的条带的个体，将其PCR产物送至公司进行直接测序(擎科，西安)，鉴定分型。

1.3 数据分析

山羊GDF9-L61L位点的等位基因频率、基因型频率、基因纯合度(Homozygosity，Ho)、基因杂合度(Heterozygosity，He)、有效等位基因数(Number of effective alleles，Ne)、以及多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)通过直接计算获得。利用卡方适应性检验鉴定各位点是否处于哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)状态。

建立一般线性模型分析不同参数对山羊产羔和生长性状的影响[16]：Yij=μ+Ai+Gi+eij。其中，Yij为观测值，μ为群体均值，Ai为年龄固定效应，Gi为基因型固定效应，eij为随机误差。利用SPSS 23.0分析各基因型与生长性状间的关联性，其中，含有2种基因型的位点运用独立样本t检验，而含有3种基因型的位点利用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 SNP位点鉴定

根据测序结果，本试验检测到位于山羊GDF9基因外显子1上的同义突变位点L61L(g.2006C>A/c.183C>A)(图1)。该位点共含有3种基因型野生纯合型(CC)、杂合型(AC)和突变纯合型(AA)。

图1 山羊GDF9基因L61L位点测序图

2.2 群体遗传参数分析

L61L含有3种基因型CC、AC和AA(表1)，该位点最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)为0.349。等位基因C为该位点的优势等位基因，其等位基因频率为0.651，三种基因型CC、CA和AA的基因型频率分别为0.391、0.520和0.089。同时，L61L位于中多态性(0.25

表1 山羊GDF9基因L61L位点遗传参数

2.3 L61L与产羔数间关联性分析

分析GDF9基因L61L位点与产羔数间的关联性发现(表2)，L61L对山羊产羔数间无显著影响(P>0.05)。

表2 山羊GDF9基因L61L位点与产羔数间关联性分析

2.4 L61L与生长性状间关联性分析

分析GDF9基因L61L位点与山羊生长性状间的关联性发现(表3，图2)，位点L61L对陕北白绒山羊的管围(P=4.95E-8)、胸深(P=5.02E-8)以及胸宽(P=4.72E-8)有显著性影响。其中，杂合型CA在管围和胸深两个生长性状中均为优势基因型，含有CA基因型的个体呈现出更好的表型，但在胸宽性状中，突变纯合型AA为优势基因型。但未发现L61L对山羊产羔数存在显著影响(P>0.05)。

表3 山羊GDF9基因L61L位点与生长性状间关联分析

图2 山羊GDF9基因L61L位点与生长性状间关联分析

3 讨 论

已有研究表明，GDF9基因作为高繁殖力候选基因，是雌性个体卵泡发育的关键调节剂。同时，还参与影响动物的生长发育，因此，有关GDF9基因对动物经济性状的功能研究具有重要意义。此外，本团队前期研究在山羊大群体(n>2000)中发现两个位于该基因第2外显子的Q320P和V397I位点处于强连锁状态，并能显著影响山羊产羔数。与此同时，笔者前期研究又发现L61L位点与Q320P和V397I接近强连锁状态。因此本研究拟在陕北白绒山羊群里中鉴定L61L位点并研究该位点对产羔数的影响。考虑到繁殖性状和生长性状的关联性，笔者还同时分析L61L位点与生长性状间的关联性。

本文首先分析了这L61L在试验群体中的分布情况。其最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)为0.349，这提示该位点在此群体中具有一个较稳定的突变频率。然而，L61L位点并不处于哈代温伯格平衡，这可能是由长期的人工选择以及遗传漂变等因素造成[17-19]。

随后，又对L61L各基因型与山羊生长性状间进行了关联分析，结果表明L61L位点能显著影响山羊胸深、胸宽和髋宽(P<0.01)。有前期研究报道，山羊DSCAML1基因的两个indel位点能显著影响该基因在不同组织中的表达量[20]，同时，山羊KDM6A基因上两个indel位点的不同基因型也被检测到，其表达量在不同时期仍有显著差异[21]。因此，笔者猜测，L61L位点可能通过影响GDF9基因相关组织的表达量，从而参与山羊生长发育调节过程[22-24]。本团队前期研究在大样本群体中发现山羊GDF9基因两个SNP位点(Q320P和V397I)处于强连锁状态，并能够共同稳定且显著地影响山羊产羔数。除此之外，MDM2基因中的40 bp indel位点与SNP(rs2279744)完全处于连锁不平衡中，并且该SNP位点已被证明与多种癌症的易感性有关，通过与SNP位点的连锁，该indel位点与结肠癌风险呈正相关关系[25]。因此，L61L位点也可能与其他主效突变位点处于完全连锁不平衡状态，从而共同影响山羊生长性状，但具体分子机制还有待进一步研究。

另外，从关联分析结果中可发现，杂合型为管围和胸深的优势基因型，具有更好的表型，而突变纯合型则为胸宽的优势基因型，这表明杂合性对管围和胸深更具有利，而突变纯合型对胸宽更有利。因此，在后续的育种工作中，可以挑选出具有性状对应优势基因型的山羊个体，进行集中培育，将优势性状进行保留。虽然L61L与前期研究发现GDF9基因上对产羔数的影响发挥主效作用的位点Q320P有接近强连锁的趋势，但是可能由于跨外显子且位置相隔较远，导致Q320P与L61L的互作作用不足以使L61L也对产羔数有显著作用。

4 结 论

本研究鉴定了位于山羊GDF9基因的L61L位点，其中L61L与山羊胸深、胸宽及管围性状间存在极显著关联(P<0.01)，提示该位点可作为有效的分子靶标应用于分子标记辅助育种中。