棉粕对盐碱胁迫下滴灌棉田微生物群落结构的影响

常豆豆，王开勇，孟春梅，安梦洁，洪大双

(石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

盐碱土是受自然成土因素和人类生产活动因素共同作用、相互影响下形成的不同盐化和碱化土壤的总称[1]。盐碱土有较高的渗透压，使得植物无法正常吸收土壤水分，甚至失水死亡，并且含有危害植物生长的物质，因此严重抑制了植物的生长发育，导致粮食减产。新疆具有特殊的气候类型，其特点为降水少、蒸发量大，滴灌技术可以有效提高水分利用率，并减少土壤板结[2]。据调查得出，新疆灌区耕地总面积占全国灌区耕地总面积的1/3，是我国重要的棉花产地之一。随着社会飞速发展，土壤生态环境日益恶化，现有的土壤资源盐碱化、土壤板结等问题越来越突出[3]，改良盐碱土成为解决以上问题的有效途径。

土壤盐渍化改良中技术手段主要有物理方法、化学方法和生物方法3种[2]，其中，生物方法克服了物理方法高成本和化学方法污染土壤环境等缺点，从经济和生态循环方面起到促进作用，而成为当今应用前景最好的盐碱土改良措施。目前，多种腐殖酸型土壤调理剂[4]、生物有机肥[5]和生物炭[6]等进入市场，通过促进土壤微生物大量繁殖达到了改变微生物群落结构的效果，进一步改良了土壤和提高了作物产量。此外，粕类也是年一种新型生物改良剂，主要包括棉粕、葵粕等[7]。新疆是中国的棉花生产大省，随着棉花产量的增加，棉粕的产量也越来越大。棉粕作为一种新型土壤改良剂，可以达到改善土壤结构，进一步改善土壤中微生物活性，改变其群落结构的目的，从而使盐碱土被改造为养分充足，结构适宜的灌溉耕地[8]。

特定环境条件下存在着对应的微生物群落,动、植物不适宜在很多极端土壤环境生存，例如盐碱土，但其存在着一定数量的微生物群落，具有耐盐碱、嗜盐碱的特性[9]；这些微生物的生命活动受土壤极端理化性质的影响，从而形成适应高盐碱环境的群落结构[10]。微生物群落是否稳定和土壤有机质的活性高低都可以由土壤微生物多样性来表示，其对植物的生长发育和群落结构的演替具有重要作用[11]。添加生物改良剂会使微生物群落结构发生改变，如水稻施用生物有机肥后，土壤细菌中放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、变形菌门等门相对丰度增加[12]；添加生物碳可提高盐碱土中硝化螺旋菌门和芽孢杆菌门的相对丰度，同时降低土壤pH，使土壤系统功能发生改变，有利于盐碱土壤的改良[13]，但是施用效果在不同土壤环境下有差异。目前对盐碱土生物改良研究较多，但棉粕施用量的配比尚未明确，不同施用量的棉粕对土壤微生物群落结构是否有影响也不清楚。

本文采用高通量测序技术[14]分析盐碱胁迫处理下滴灌棉田土壤微生物群落结构多样性的情况，探究棉粕对滴灌盐碱胁迫土壤微生物群落结构的影响，从而为棉粕在改良新疆盐碱化滴灌棉田的施用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

新疆石河子市地处天山北麓中段，准噶尔盆地南部，地理坐标位于E84′58″～86′24″，N 43′26″～45′20″。本研究田间试验于2017年在石河子大学试验站进行，2016年种植作物为棉花，基本土壤理化指标pH为7.73，电导率(1∶2.5)为280 μs/cm，全氮为0.5 g/kg，有机碳为16.19 g/kg。棉花品种为新陆早60号(Gossypium hirsutumcv.Xinluzao 60)，试验田所用肥料为棉粕与复合肥(N∶P2O5∶K2O=20∶15∶9)配施。

1.2 试验设计

以早熟陆地棉品种新陆早60号为试材，在2016年用NaCl和Na2CO3分别对试验小区土壤进行盐化、碱化，直至小区土壤达到设定的含盐量8 g/kg。于当年4月初将棉粕定量的均匀撒入小区，为了棉粕充分进入土壤，在原地进行浅翻(深度为0～20 cm)，使棉粕在土壤中提前腐熟。试验小区面积5 m2，小区间距1.4 m，每个处理重复3次，共18个小区。

试验盐胁迫处理Y0为NaCl+0 kg/hm2棉粕，Y1为NaCl+3 000 kg/hm2棉粕，Y2为NaCl+6 000 kg/hm2棉粕；碱胁迫处理J0为Na2CO3+0 kg/hm2棉粕，J1为Na2CO3+3 000 kg/hm2棉粕，J2为Na2CO3+6 000 kg/hm2棉粕。

试验采用滴灌模式，一膜三管六行，宽窄行处理，宽行距50 cm,窄行距30 cm。全生育期滴灌量4 200 m3/hm2;其它常规管理措施同当地大田一致,10月收获。

1.3 样品采集

在棉花收获期于各个小区依次进行采样。每个小区采集深度为0～20 cm的三钻土样，混合均匀后分成2份土样，一份室内风干用于后期土壤理化性质的测定，另一份放于灭菌密封袋，置于-20 °C后期进行微生物群落结构多样性分析。

1.4 指标测定方法

(1)土壤微生物多样性。取0.5 g土壤试验样品提取DNA,将获得的土壤DNA样品保存于-20 °C冰箱中用于后期高通量测序，其16S引物扩增区间为V3+V4区(F:5′-ARACTYCTACGGRAGGCWG-3′;R:5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′),其后续测序委托给北京百迈客生物科技有限公司完成相关测序。

(2)对风干及过筛后土壤样品进行pH、电导率(土壤:水=1∶2.5)、有机质、总氮理化性质分析。pH 和电导率使用pH仪和电导率仪测定，土壤全氮用凯氏定氮法，有机质采用重铬酸钾容量法-外加热法测定。每个样品3个重复,取其平均值。

1.5 数据处理

利用 Microsoft Excel 2010和Origin 2018进行数据处理及作图；采用SPSS17.0统计学软件进行单因素方差分析(ANOVA)和多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 棉粕对盐、碱胁迫下灌溉棉田pH和EC的影响

棉花收获期不同处理灌溉棉田的土壤pH、EC分别如图1所示。由图1可见：各处理间土壤pH在 7.5 以上，均呈碱性。在盐胁迫处理下，随着棉粕施用量的增加，Y1与Y0处理相比，pH值下降1.02%，EC下降28.77%；相反，Y2处理较Y0的pH值高2.07%，EC低7.29%。在碱胁迫处理下，与J0处理相比，J1处理的pH值高4.04%(P<0.05)，J2处理pH值增加2.38%，J1和J2处理的土壤电导率分别增加57.74%和10.25%。

图1 不同处理对滴灌棉田pH(a)和EC(b)的影响

2.2 棉粕对盐、碱胁迫下灌溉棉田全氮和有机碳的影响

棉粕对盐、碱胁迫下滴灌棉田的土壤全氮和有机碳影响的结果(图2)显示：

图2 不同处理对盐、碱胁迫下滴灌棉田全氮和有机碳的影响

(1)在盐胁迫处理下，添加棉粕后土壤全氮的积累量均显著增加，Y1处理较Y0处理增加7.79%(P<0.05)，Y2处理较Y0处理增加3.90%。在碱胁迫处理下，与J0相比，添加棉粕后土壤全氮的积累量变化有所波动，J1处理增加2.67%，而J2处理下降4.17%。

(2)在盐胁迫处理下，添加棉粕后土壤有机碳的积累量降低；与Y0处理相比，Y2处理并没有发生显著性变化，Y1处理减少5.14%(P<0.05)。在碱胁迫处理下，与J0处理相比，添加棉粕后处于显著降低趋势，J1、J2处理分别降低17.13%、12.82%。

2.3 土壤生物信息学分析

2.3.1 OTU聚类分析

将6个样品进行OTU聚类分析，结果(图3)显示：盐、碱胁迫处理下共有的OUT为1 161个，Y0处理下特有的OUT为101个，Y1处理下有119个特有的OUT,Y2处理下特有的OUT有112个。碱胁迫处理下，J0下特有的OUT为94个，J1处理下有89个特有的OUT，J2处理下特有的OUT为83个。可见不同处理下土壤中OUT数为Y1>Y2>Y0>J0>J1>J2,说明盐胁迫处理的土壤微生物类群比碱胁迫处理的土壤微生物类群丰富，在Y1处理下土壤微生物类群最丰富，而且在不同处理下有部分一致的微生物类群，但整体上差异较明显。

图3 土壤样品微生物OTU数量的韦恩图

2.3.2 棉粕对盐、碱胁迫下土壤细菌群落组成影响

基于 OTU 结果用不同颜色变化表示不同样品在门水平上的群落组成相似性，土壤样品通过高通量测序后先后共获得11个门和不确定类群，结果见图4。由图4可见：

不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

(1)11个门分别属于古菌域的变形菌门(Proteobacteria)芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。施加棉粕后，盐、碱胁迫处理后土壤中占优势的菌门有变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门和放线菌门。

(2)放线菌门和芽单胞菌门在添加棉粕处理后较高，总体来说，添加棉粕使得盐、碱胁迫处理后土壤中变形菌门(Proteobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)数量增多，使酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的数量减少，但各处理间相对丰度无显著性差异。

2.3.3 群落结构物种差异性分析

为了研究样品间微生物群落丰度的差异，筛选的不同处理下两个类群前10个物种进行组间差异性分析，结果(图5)显示：在盐、碱胁迫处理下，前10个物种不尽相同，施加棉粕后土壤中的各物种较空白有显著差异。

由图5a可知，棉粕处理(Y1，Y2)显著降低放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和Latescibacteria的细菌相对丰度(P<0.05)，同时显著增加绿菌门(Chlorobi)和蓝藻细菌(Cyanobacteria)的相对丰度(P<0.05)。Y1处理能显著增加广古菌门(Euryarchaeota)的丰度(P<0.05)，Y2处理显著增加装甲菌门(Armatimonadetes)的丰度(P<0.05)。

由图5b可以看出：施加棉粕后变形菌门(Euryarchaeota)未发生显著性变化，拟杆菌门(Bacteroidetes)在J1处理下与未施加棉粕相比呈现显著性增加。衣原体门(Chlamydiae)在J2处理下显著性增加，其余微生物菌门在施加棉粕后都呈现显著性变化(P<0.05)。

图5 群落结构物种差异性分析

2.4 土壤环境因子RDA分析

为了更清楚地了解土壤各环境因子对微生物群落结构影响情况，分别对盐碱胁迫下灌溉棉田的微生物群落与环境因子进行RDA分析,结果如图6所示。

图6 土壤环境因子RDA排序图

由图6可知：土壤环境因子pH、EC、TN和有机碳SOC对盐、碱胁迫下微生物群落结构的影响不同。4种环境因子对盐胁迫处理下土壤微生物群落总解释率为72.18%，碱胁迫处理下为73.14%。碱胁迫处理下PC1和PC2分别为0.532 4和0.199 0，占总特征值的73.14%，这说明排序轴的土壤环境因子相关系数较高，解释了环境因子和微生物群落结构总方差的73.14%。整体来看，盐碱土壤微生物群落结构与土壤环境因子的RDA排序效果均较好。

盐胁迫处理下RDA排序图(6a)显示：土壤的pH、电导率和有机质之间呈正相关，三者共同作用促使微生物群落结构发生变化，与三者土壤全氮呈负相关。土壤的pH、电导率和有机质积累越多，对微生物群落结构的影响越大。

碱胁迫处理下RDA排序图(图6b)显示：土壤的pH、电导率和与全氮呈正相关，与有机质呈负相关，且电导率对碱土微生物群落的影响最大，电导率越大，对微生物群落结构的影响也越大。

3 讨论

(1)土壤中盐分随着水分运动，因此水分运移必定会对土壤pH和EC产生影响，土壤pH和EC都直接或者间接影响土壤微生物群落结构。李新[15]等通过研究不同盐碱程度下土壤微生物得出，随着土壤电导率(EC)升高，盐碱土壤结构松散程度逐渐加剧，而土壤稳定性变差不利于微生物的生存；陕红[16]在研究有机物料对盐碱度影响时发现，同一种有机物质施入到不同种类的土壤对pH和EC的影响程度不一样，当棉粕施入盐、碱化土壤中,碱化土壤pH比盐化的高很多，棉粕施入盐碱化土壤后对其pH影响作用也不相同；总体上添加棉粕后土壤pH影响有波动，但是影响不显著。在一定程度上添加棉粕可以降低pH，盐化土壤pH降低的幅度大于碱化土壤的，添加棉粕会使碱化土壤pH略微增加，但是棉粕对土壤pH的影响往往小于盐碱本身对土壤pH的影响。土壤pH值是土壤肥力和酸碱度的重要指标，pH越低，微生物群落结构越复杂。邓欣等[17]研究表明土壤全氮和有机质是土壤微生物生命活动的能量来源。土壤有机质积累量越大，微生物群落结构越丰富[18]。本研究结果表明，随着土壤盐、碱胁迫程度的加剧，土壤中微生物群落结构也在发生改变；经过RDA分析表明，盐胁迫处理后土壤微生物群落结构变化与土壤的pH、电导率和全氮关系密切，土壤全氮积累量越多，对微生物群落结构的影响越大；而碱胁迫处理后土壤微生物群落结构变化与土壤pH、电导率和与有机碳关系密切，碱胁迫处理后土壤微生物群落变化与土壤有机碳的积累量相关，有机碳积累量越低，J2处理后土壤微生物群落结构变化越大，说明不同盐、碱程度下土壤微生物群落结构有明显的区别。

(2)微生物种类、数量及代谢活动状况有利于改善土壤结构，促进良好土壤环境的形成[3]；本研究表明，棉粕作为有机质施入盐、碱胁迫处理土壤中，为微生物提供了生存物质。土壤中微生物种群的数量及种类都非常庞大，王薇琦等[19]在研究干旱区不同类型土壤细菌群落时发现，碳酸盐型土壤菌群主要包括10个门类，其中优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)，本研究表明所得序列被归为11个门，盐碱胁迫处理下占优势的菌门有变形菌门、放线菌门和芽单胞菌门，优势菌门是变形菌门，其中疣微菌门和厚壁菌门所占比例较小，说明盐碱土壤处于不同地域和类型，优势种群和构成的群落结构也并不完全相同，这与文献[1]研究结果一致。加入棉粕后可使盐碱土壤衍生出较多的微生物种群，出现本研究中这种比例上差异的原因可能是由于棉粕的施用使土壤有机质含量增加，从而微生物群落结构发生变化。赵婉雨等[20]对达布逊盐湖微生物的研究得出优势菌门为变形菌门和疣微菌门，牛世全等[21]研究发现河西走廊原生盐碱土和农田土中的优势菌门为变形菌门，本文研究结果发现的优势菌与之一致，这说明在盐碱土壤环境下微生物群落分布具有相似性，且放线菌门与变形菌门是盐碱土中最普遍的2种。另外，本研究发现施用棉粕后土壤中变形菌门和芽单胞菌门数量增加，这可能是因为变形菌门和芽单胞菌门中的细菌群体更偏好利用棉粕，从而促进群体增加，而酸杆菌门和放线菌门数量减少是因为其不能很好的利用棉粕；碱胁迫处理对土壤微生物群落结构的影响大于盐胁迫处理，可能是因为高pH对微生物有更大的毒害作用。

(3)应用土壤改良剂是修复盐碱土壤的重要措施之一。近年来，在土壤改良剂的筛选方面展开了大量工作。刘玉国等[22]以31种物质进行盐渍化土壤改良剂的筛选，通过对改良剂改良后土壤pH值和EC的测定发现，葵粕、棉粕和柠檬酸改良盐碱化土壤效果更显著。通过微生物发酵棉粕产生的腐植酸制成肥料，所形成的腐植酸肥料有改良土壤结构、提高土壤肥效、增加作物产量等功效[23]。王凡等[24]施用生物炭改良盐碱土土壤时发现，少量的生物炭能够使新疆盐碱土壤的pH值和含盐量增加，能有效提高土壤有机质的含量，全氮的积累量也有所增加。本研究结果中，经棉粕处理后土壤的pH值与电导率(EC)的变化与上述研究一致，在盐胁迫处理下呈下降趋势，在碱胁迫处理下呈上升趋势，其pH值降低可能是由于土壤灌溉和淋滤作用增加，土壤中盐分离子随着水分向下运移；相反，滴灌棉田的土壤EC增加可能是由于表层土壤的蒸发作用较强，使土壤下层积累的盐分随着水向表层土壤移动，水分蒸发后使得盐停留在土壤表层，从而出现土壤表层的电导率增大的现象[25]，而且棉粕施入土壤后被降解成养分，同时会释放导电离子，也可能导致EC增大；盐、碱胁迫处理土壤中施入棉粕后，棉粕的加入激发了土壤中的有机碳和全氮，盐胁迫土壤中碳氮含量及储量高于碱胁迫土壤，可能原因是与盐土和碱土本身性质有关。

在盐胁迫土壤中全氮含量随着棉粕的施入而增加，说明土壤的有机碳呈现下降趋势，出现这种现象的原因可能是由于土壤微生物通过分解棉粕使土壤中的有机碳含量发生变化，随着生育期的推后，土壤中微生物对棉粕的分解量减少，使得收获期时残留在土壤中的有机质含量较少[26]。袁颖红等[27]研究表明在盐碱土中施加生物炭能显著增加微生物量，本研究表明施用不同梯度的棉粕后土壤中微生物数量增加，土壤微生物群落结构相较未施加棉粕的丰富，优势种丰度未显著增加。

4 结论

(1)盐、碱胁迫处理后其优势菌门是变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门，其中变形菌门比例在盐、碱胁迫处理下最大分别可达到34.81%和34.18%。施用棉粕后各处理间土壤微生物群落组成无明显差异，施加棉粕土壤中优势种群的相对丰度。

(2)棉粕对于缓解盐、碱胁迫有积极作用，当棉粕添加量在3 000 kg/hm2时，土壤中pH显著下降。盐胁迫处理下滴灌棉田pH值和全氮的积累量增加，土壤电导率和有机碳的积累降低；碱胁迫处理下效果不明显，土壤的pH和电导率都有所增加，全氮积累量降低。施用少量棉粕对盐胁迫处理土壤修复效果较好，施用大量棉粕对碱土修复效果较好。

(3)在盐胁迫处理下，土壤全氮和电导率是影响微生物群落结构的主要因子；碱胁迫处理下土壤pH，电导率和土壤全氮是影响微生物群落结构的主要因子。