组织工程和再生医学在预防内镜黏膜下剥离术后食管狭窄的研究进展

俞姝含，李文杰

【提要】 随着内镜技术和设备的不断发展，目前内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)逐渐成为早期食管癌的首选治疗方法。然而，术后食管狭窄仍然是一个棘手的问题。目前大部分聚焦都在药物及支架的防治上，本文综述了再生医学与组织工程在预防内镜黏膜下剥离术后食管狭窄的研究进展，以期发掘食管ESD术后狭窄预防的潜在方法和未来研究方向。

食管癌是导致世界癌症相关死亡的第六大常见原因[1]。食管癌如果在早期发现并进行干预，预后一般良好[2]。ESD可以一次性完整切除较大的病灶，并进行准确的组织病理学检查，具有较小的侵袭性和良好的临床结果进而被广泛接受[3-5]。自ESD发展以来，适应症逐渐扩展到包括先前通过手术治疗的较大病变[6]。然而，当ESD用于切除大面积黏膜(即>75%的食管管腔)的广泛表皮肿瘤时，不可避免地会出现严重的术后食管狭窄[7]。残留的黏膜缺损可引起急性炎症反应、深部溃疡、黏膜下纤维结缔组织增生、壁纤维化和食管狭窄[8]。

内镜治疗后的严重食管狭窄很难治疗，通常需要反复内镜球囊扩张或临时支架置入[9]。有研究显示，内镜治疗后黏膜下层的扩张和肌层的萎缩导致食管狭窄[10]。因此，预防食管狭窄旨在减少黏膜缺陷、缓解炎症和防止过度扩张的干预。再生医学和组织工程是近年来发展的一个生物学新概念，是干细胞和细胞生物学、组织与器官的再生及工程化、产业化与临床应用[11]。医学再生为器官治疗和移植提供了一种创新方法。组织工程技术在结构和功能上重建正常组织并促进食管黏膜早期再上皮化以防止ESD术后狭窄。最终目的在于以移植的材料替代受损的黏膜组织同时保持原有生理功能，达到伤口的无疤痕愈合。其方法包括细胞片移植、细胞外基质生物材料移植、自体移植和内镜下自体细胞悬浮注射等。

1 细胞片移植

1.1 自体口腔黏膜上皮细胞片(oral mucosal epithelial cell sheet，OMECs)

2006年研究者在犬类模型中使用OMECs移植治疗食管溃疡，移植四周后均未产生狭窄[12]。2009年的研究以猪小肠黏膜下层与培养的OMECs移植用于犬模型中食道修复，证明了自体口腔黏膜上皮促进伤口愈合以防止术后瘢痕形成的生物学过程[13]。而后，Takagi等[14]在2010年于实验室成功培养了来自7名健康志愿者供体的人口腔黏膜上皮细胞，并用于干预ESD后的犬食管溃疡模型。证明了人类口腔黏膜上皮细胞可被培养并以连续细胞片的形式收获，具有促进食管溃疡再上皮化的功效。同年，Honda等[10]发现犬类食管EMR术后进行自体口腔黏膜上皮细胞移植可以减少术后炎症反应，促进上皮和肌肉再生。2012年OMECs首次应用于人，9名食管鳞癌患者在ESD术后移植OMECs，其中8名预防了术后狭窄[15]。研究者预先收集了患者的口腔黏膜组织标本，于体外制造上皮细胞片。这些细胞片通过内镜在术后直接移植到食管溃疡表面。术后所有手术创面均发生了完全的上皮再形成，中位时间为3.5周。除1例患者的全周溃疡扩展到食管胃交界处，其它患者手术后未出现吞咽困难、狭窄或其他并发症。这种由自体口腔黏膜上皮细胞组成的无载体细胞片的无缝线内镜下移植安全有效地促进了食管黏膜的再上皮化。移植的细胞片可以作为再生上皮细胞的细胞来源，同时其分泌的生长因子和细胞因子促进了伤口愈合。2017年日本的另一项研究进一步证实了OMECs的临床可操作性，Naoyuki等[16]将10例患者的OMECs经长途空运后用于ESD术后，当中6名未发生术后狭窄、吞咽困难或其他并发症，证明了OMECs在长距离和长运输时间内的安全性和有效性。体现出了OMECs的一个巨大优势，可以通过集中培养和分配的方式打破地域和技术限制。

近年来，由OMECs片产生外泌体的再生潜力已成为关注话题。多项研究均证实了来自OMECs片产生的外泌体对皮肤伤口愈合具有再生作用[17-18]。OMECs+外泌体治疗也是目前的研究焦点，如何更好地使用外泌体来治疗术后创面并实现外泌体与伤口的高粘附仍亟待研究。同时，目前该技术的高成本和制造难度限制了其广泛使用。这些问题可能是未来OMECs和外泌体能否直接结合用于临床治疗的关键。此外，OMECs产生的外泌体直接转化为治疗药物形成量产可能会成为新的研究方向。

1.2 自体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)

目前，ADSCs在临床多用于创面愈合，较广泛运用于医疗整形和美容行业[19]。ADSCs易于分离并具有旁分泌活性，可以参与局部免疫调节、细胞募集和新生血管形成[20]。最新研究表明它可调节角质形成细胞与成纤维细胞的相互作用，抑制过度纤维化发展[21]。在预防食管狭窄方面，研究者在犬类模型中进行了对照实验证实了自体ADSCs注射治疗可抑制食管黏膜收缩并改善临床症状[22]。此外，有研究证明了ADSCs双细胞片在猪模型中内镜下移植可以有效预防食管ESD术后狭窄[23]。实验组中狭窄率明显降低，且猪进食效率明显高于对照组，证实ADSCs双细胞片的移植可以降低了狭窄程度并延缓纤维化的发展。ADSCs具有抗炎特性、参与局部免疫调节、新血管形成诱导以及分化为间充质和非间充质谱系的能力[24-25]，这解释了在动物实验中预防食管ESD术后狭窄的原理。尽管此项技术对食管ESD术后狭窄的作用仍处在动物实验阶段，尚未有临床实验，相信在不久将来可以为病人带来福音。

1.3 自体皮肤表皮细胞片

Kanai N等[26]制备的自体表皮细胞片用于预防并治疗猪模型中环周食管ESD术后的食道狭窄。4只猪接受了手术后立即进行自体表皮细胞片移植，其他4只仅进行手术，在ESD后2周分别进行尸检和组织学评估。对照组样本均出现严重的食管收缩，组织学具有较厚的黏膜下层，肌肉层中纤维组织浸润。而实验组猪食管轻度狭窄，缺损处炎症细胞较少，组织学上可见早期再生上皮，肌层轻度纤维化。

目前关于自体皮肤表皮细胞片的临床前研究仍很少，样本量少，没有大规模临床试验的证据。这使得很难从这些研究中得出严格的结论。

1.4 细胞片工程

细胞片工程可以移植单层细胞片到母体组织，也可以通过叠加多层制得三维结构应用于组织再生[27]。它可以利用温度敏感的聚合物形成无支架、可移植的细胞片。此类材料能够不被蛋白质水解酶所反应，可避免机械或酶处理引起的细胞表面蛋白和细胞外基质的损失[28-29]。这种方法已被证明在治疗和修复损伤的组织或器官，现已在骨、软骨、血管疾病、皮肤等领域取得了成功[30]。

目前尚未有研究此技术在食管ESD术后狭窄预防中的运用。然而，动物的临床前期研究和临床研究都已经证明了细胞片工程制备的细胞片具有很强的再生能力[31]。因此，该方法有望在未来运用在食管ESD术后狭窄预防上，可以为患者提供新的黏膜移植材料。

以MPP为采样中心的重要抽样策略可以增大样本落入失效域的概率，进而减少仿真样本数[24]。其失效概率计算公式[24]为：

2 自体移植

2.1 自体皮肤移植(autologous skin graft，ASG)

我国研究者首次将自体皮肤移植以预防食管内镜下黏膜下隧道剥离后食管狭窄[32]，此研究纳入了8例全周食管鳞状细胞癌的患者，取患者右外大腿进行移植，覆盖食管支架外部，内镜下通过钢套锁环将支架固定防止移位。其中5例患者在平均7个月的随访中没有出现狭窄。此后，中国解放军总医院进行了一项回顾性研究，一共90名患者进行了防止食管ESD术后狭窄的干预措施，这当中19名患者接受了自体皮肤移植，移植后狭窄率较基线显著降低[33]。

2.2 自体胃部黏膜移植

Hochberger等人[34]将患者自体胃窦黏膜移植到食管环周ESD术后的黏膜缺损区，以金属支架固定组织。六个月后缺损几乎完全愈合，表明胃黏膜移植预防狭窄的有效性。移植的胃黏膜在食管内呈圆周状扩散，有效的预防了食管狭窄。然而，取材胃窦黏膜后会残留黏膜缺损，造成胃酸分泌增加，从而引起胃部不适症状甚至溃疡。

2.3 自体食管黏膜移植

我国对自体食管黏膜移植的研究首先在动物实验上得到了验证[35]，对猪模型平分两组(n=6)进行了食管环周ESD。实验组中制作自体皮瓣，放置在原切除部位并用金属夹固定，对照组仅接受手术。术后3周，自体皮瓣组仅有轻微狭窄，对照组有明显狭窄。这种方法仅在小规模动物研究中进行了短期测试，仍需大规模研究来评估此方法的长期影响。Liao等[36]进行了临床研究，在食管环周ESD术后将自体正常食管黏膜移植于溃疡表面，以金属网支架固定，1周后取出支架。患者上皮形成的中位时间为7.1 d，移植成功率达96.5%。9例患者中有8例出现狭窄，内窥镜球囊扩张的中位数为2.7次，自体食管黏膜移植并没有降低狭窄形成的发生率。尽管如此，这种方法减少了扩张次数，减缓了术后食管狭窄的进程。张金顺等[37]在食管ESD后夹取预先取出的食道黏膜组织附着于术后创面，3例患者在术后仍发生了狭窄反应，但狭窄程度较单纯手术患者较轻。

自体移植需要通过金属支架附着在食管缺损处，吸收受体部位的液体和营养成分，最终通过血管形成到受体部位而存活。增加移植成功率是未来的研究目标之一。尽管对该主题已进行了多项研究，研究结果仍然有限。目前临床运用样本量偏少，有待大规模临床实验证实，但已有研究结果表明自体移植是预防食管ESD术后狭窄的安全有效策略。

3 细胞外基质生物材料移植

3.1 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)

ECM的基底部者为基底膜，而在细胞间黏附结构者为间质结缔组织[38]。它不仅负责构成复杂的网架结构，并支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。它调节许多生物过程[39]，可参与细胞分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程，影响神经支配和伤口愈合，并对于胚胎发育和维持细胞和器官的稳态有重大作用[40]。因此，ECM可作为一种理想的生物材料，促进受损食管黏膜修复。近年来，ECM生物材料的制造取得了巨大的发展，包括脱细胞技术和基于ECM的生物复合材料工程的发展。

3.2 脱细胞技术

脱细胞技术是将异体组织经过生物学和化学的工艺方法处理，去表皮、脱细胞，保留了细胞外基质的形态、三维结构和成分，为宿主细胞提供了生长和代谢场所，促进自体成纤维细胞及血管内皮细胞生长，从而完成对缺损组织的修复和重建[41]。此项技术不仅可以制作脱细胞真皮基质，还可以制备脱细胞血管、神经、软骨基质等[42]。近年来，由于ECM支架制造方法的发展，脱细胞组织材料已广泛应用于临床组织修复和重建，已用于疝气修复、皮肤缺损修复、乳房重建、心脏瓣膜和心包修复[43]。近年来陆续也有学者聚焦到食管黏膜修复，临床前动物研究中发现[44]，ECM支架放置显然对宿主反应具有益处，避免了食管术后的顽固性狭窄并促进了建设性重塑。有实验表明ECM支架降解导致形成隐性肽，这些肽是内源性干细胞和祖细胞的强效引诱剂，有助于构建性重塑过程[45-46]。临床实验中也得到了相似结论，食管浅表腺癌患者完全切除病变后，放置管状ECM生物支架有助于恢复正常食管上皮并预防了术后狭窄[47]。

尽管脱细胞技术在临床应用中取得了成功，仍然存在一些问题。脱细胞技术去除组织中的细胞和抗原成分，过程中不可避免地导致一定程度的ECM破坏。另外，供体组织的异质性可能导致脱细胞过程的异质性，进一步导致脱细胞组织的异质性。此外，ECM补片和支架的结合度以及支架移位问题仍需要解决。已有研究使用金属夹固定ECM贴片在猪食管ESD术后取得了不错的结果[52]，但这需要在临床试验中进行验证。生物支架内镜缝合是未来的研究方向，但其技术难度较高，还需克服重重困难，可行性仍有待讨论。

3.3 基于ECM的生物混合材料

目前用于功能性组织修复的ECM材料可分为合成材料和天然材料。合成材料通常由人造聚合物、金属或其他合成材料组成，具有融合多种材料的个性化性能[53]，但也可能在宿主中引起免疫排斥反应[54]。天然材料通常由单纯ECM成分提纯或者加工，具有高度异质性，对宿主的免疫反应友好。结合两者特点，复合ECM生物材料可以利用纳米纤维光刻、静电纺丝和三维打印等技术[55]，天然与合成材料相结合可以实现优势互补。通过将天然ECM与聚合物成分相结合，选取最佳组合使用在支架中，这种组合称为基于ECM的生物混合材料。

4 自体细胞悬液内镜下注射

已有研究使用自体细胞悬液移植治疗皮肤黏膜损伤，取得了良好成效[56-57]。内镜下注射自体细胞悬液是一种从口腔、皮肤或脂肪组织中提取细胞，制备用于内镜下注射悬液的技术[58]。目前用于制备预防食管ESD后狭窄的自体细胞悬液包括有OMECs悬液、皮肤角质形成的细胞悬液和ADSCs悬液。

内镜下注射自体细胞悬液对预防食管癌术后狭窄有效，在动物实验中得到了一系列证实。目前已经进行多项动物实验。Sakurai等[59]对猪模型中行食管内镜下治疗后，直接将自体OMECs悬液内镜注射到黏膜下组织中，降低了术后狭窄发生。Zuercher等[60]对9只绵羊行食管环周EMR后在黏膜缺损处注射自体角质细胞液，术后均未产生食管狭窄。Honda等[22]报道了对犬模型中进行食管创面基质细胞液注射，干预了食管术后狭窄进程。

自体细胞注射具有操作简单快速的优点，其制备后可直接进行内镜下注射。然而，它从组织中分离的细胞数量有限，限制了其制备能力，而移植细胞的低存活率也是问题。有部分学者对这种方法是否会增加肿瘤进展的风险持怀疑态度，这也是未来需要研究和解决的问题。

5 与组织工程技术相关的其他治疗

5.1 自组装肽基质

法国的研究者们在食管伤口上应用自组装肽基质延迟了狭窄的发生[61]，证明了自组装肽 基质作为内窥镜切除术后伤口敷料以预防食管狭窄的有效性。此团队于今年取得了新的研究成果，他们在猪模型行食管环周内镜下切除术后使用改良过的自组装肽基质进行伤口敷料，直接降低了实验组术后狭窄的发生率[62]。

5.2 高密度胶原蛋白贴片

Aoki S等[63]的研究中6只猪均进行了环周食管ESD术，3只术后创面均用2个胶原蛋白补丁覆盖，另外3只仅进行手术。术后14 d，使用胶原蛋白贴剂治疗组的创面黏膜炎症和纤维化的程度显著降低，细胞内α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞明显减少。此研究确定高密度胶原蛋白贴片在环周ESD中预防术后狭窄的功效。

5.3 间质干细胞条件培养基

Mizushima等[64]采用ESD法切除猪食管半周，通过5%甲基纤维素混合制备间质干细胞条件培养基凝胶，并于ESD后每周通过内镜将其涂抹在手术伤面上。对照组将曲安奈德注射到剩余的黏膜下层。结果以测量狭窄率并进行组织学分析。证明了间质干细胞条件培养基凝胶通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞浸润后的肌成纤维细胞活化和纤维化来防止狭窄的形成。

但以上与组织工程技术相关治疗所得的实验均为小样本短期动物实验，还未有大规模的临床实验运用。

6 结论和展望

近年来成为热门话题的组织工程和医学再生技术主要通过在结构和功能上重建正常组织，促进早期再上皮化来预防ESD术后食管狭窄。组织工程和再生医学的各种食管ESD后狭窄预防策略都不可避免地有其自身的局限性。大部分的材料和技术仍局限于实验室中，部分前期试验样本仍为小规模动物试验，投入临床前仍需要进一步扩大样本量。虽然有部分措施已在临床治疗中使用，但对于大面积黏膜缺损(特别是缺损覆盖食管周长3/4以上)的病例，其预防狭窄的效果仍有限。

不断涌现出的新材料和技术使得组织工程和医学再生技术不断发展，也有越来越多的研究倾向于它可能成为预防食管ESD后狭窄，尤其是环周食管狭窄的新方法。然而，需要更多的大规模、多中心的临床研究来证实其长期的安全性和有效性。如何将新材料技术从实验室走出转化为临床可用材料，未来还有很长一段路要走。临床运用前期工作无外乎发现并证实，需要在发现新材料后积极展开相应效应性的验证。在学科融合的背景下展开跨专业联合研究，基于各领域所长从多个角度分析解决问题，加速临床前期工作的进行，最终推动临床运用的进展。

未来期待更多研究以促进组织工程和再生医学在预防食管ESD术后狭窄的发展，例如可以扩大临床治疗的样本量，进行长期随访；在治疗效果上与激素及支架治疗研究进行比较、并对相关并发症的诊断和治疗的安全性和有效性上进行调整；不断尝试新材料，融合新技术，改进可用的材料和技术以降低成本和设施要求，实现医用产能的最大化以造福患者。