未明原因婴儿肝内胆汁淤积症中SLC25A13基因变异特征

方玲娟，林小春，徐彰，黄开宇，陈桧平，闫秀梅

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童消化科，浙江 温州 325027

Citrin缺陷病（Citrin deficiency, CD）由SLC25A13基因变异导致编码Citrin蛋白缺失和功能异常引起的一种常染色体隐性遗传性疾病。临床上主要包含CD缺陷所致的新生儿肝内胆汁淤积症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD）[1]、CD所致的生长发育落后和血脂异常（failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD）[2]和成人发病瓜氨酸血症II型（adult-onset type II citrullinemia, CTLN2）[3]三种类型[4]。

NICCD是一种泛种族疾病，尤其以东南亚国家多见，我国多省市均有NICCD的报道，各地发病率、SLC25A13基因变异特征及携带率均存在一定的差异。迄今为止，浙江省关于婴儿肝内胆汁淤积症中SLC25A13基因变异的相关文献仅有3篇，共报道了6例NICCD患儿，其中1例合并胆道闭锁。本研究分析温州医科大学附属第二医院育英儿童医院就诊的未明原因婴儿肝内胆汁淤积症中SLC25A13基因的变异特征，了解本地区的疾病谱特征，为临床诊疗提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2016年1月至2020年12月在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童消化科住院的未明原因婴儿胆汁淤积症病例。纳入标准：①年龄小于1岁；②结合胆红素升高（血清总胆红素高于85 μmol/L，结合胆红素占总胆红素的20%以上；或者血清总胆红素低于85 μmol/L，结合胆红素大于17 μmol/L）。排除标准：①除外肝外胆道疾病，包括胆道闭锁、胆道囊肿或肿瘤等；②除外持续谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）低于50 U/L和（或）总胆汁酸（total bile acid, TBA）低于10 μmol/L；③除外感染（包括细菌感染，如尿路感染、败血症等，以及血清学阳性病毒感染，如弓形虫、风疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、HIV、梅毒螺旋体感染等），但未排除巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染患儿，因为CMV感染在婴儿中常见，感染后其预后与未感染患儿无明显差异，且存在CMV感染并不能排除其他病因，尤其是遗传性病因；④排除甲状腺功能低下、静脉营养史等。

1.2 方法 经温州医科大学附属第二医院育英儿童医院伦理委员会批准，并经患儿家属签署知情同意书后，留取患儿及其父母亲的外周EDTA抗凝血 2 mL，抽提基因组DNA。先证者基因组DNA样本进行二代测序（包括胆汁淤积性肝病Panel或者全外显子组测序），并加测SLC25A13基因常见的两个大片段热点变异位点c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb。再根据二代测序检测结果，对患儿及其父母DNA标本进行SLC25A13基因Sanger测序验证。

1.2.1 二代测序（next generation sequencing, NGS）及一代验证：采用液相捕获试剂盒捕获，通过NGS仪IlluminaHiSeq 2000（美国Illumina公司）完成高通量测序，测序平均深度不小于200。根据所得数据，进行基因序列生物信息学分析，发现的变异位点再进行一代测序验证。此部分分别委托北京迈基诺基因检测公司和北京金准基因检测公司完成。

2.3 新发变异L603P的致病性分析 该变异位点位于SLC25A13基因的第17号外显子，通过检索中国知网、万方、PubMed等数据库，均未见文献报道，为新发现的变异位点。通过检索多个人类遗传变异体数据库，发现该位点在不同地区不同人群中的等位基因变异频率极低：在千人数据库中为0；在EXAC数据库中不同人群中均为0；在GnomAD数据库中东亚和南亚人群为0，欧洲人群中则为1.8/10万。对该变异位点氨基酸保守性分析显示此位点氨基酸在不同物种间具有高度保守性，见表2。另外，多个变异功能预测软件分析均显示该位点变异为致病性变异。具体如下：在Mutation Taster分析中显示该位点变异可显著影响功能，为致病性变异，其分值为0.871（分值越接近1，功能影响越大）；在SIFT分析中显示为有害变异，分值＜0.001（＜0.05提示为有害变异）；在Provean分析中提示为有害变异，分值为-6.73（≤-2.5提示为有害变异）；在Polyphen2分析中提示为有害变异，分值为0.832（＞0.8提示为有害变异）；在M-CAP和CADD分析中均提示为致病性变异，分值分别为0.304（＞0.025提示为致病性）和28.2（＞20提示为致病性）。

2.2 基因检测结果 30例中10例进行了胆汁淤积性肝病Panel检测（包含SLC25A13基因），18例进行了全外显子检测，另有2例直接进行SLC25A13基因全部外显子检测。同时所有病例都加测了中国人群中常见的大片段变异位点c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的检测。共发现12例患儿携带SLC25A13基因变异，其中2例纯合变异，5例复合杂合变异，5例杂合变异，见表1。SLC25A13基因的总检出率为40%（12/30）。在8例存在明显瓜氨酸血症的病例中均检测到存在SLC25A13基因致病性变异，其中2例纯合、4例复合杂合以及2例杂合。还有4例虽然不存在血氨基酸代谢异常，仍检出SLC25A13基因致病性变异，包括1例复合杂合变异和3例杂合变异。另外3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患儿均未检出到SLC25A13基因变异。共检测到19个致病性变异位点，7个不同的变异类型，包括中国人群中最常见的4个致病性变异，分别为c.852_855delTATG，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb，以及2个次常见致病性变异c.1177+1G＞A和c.1399C＞T，同时发现一个未报道的新发变异位点c.1808T＞C，p.L603P。其中c.852_855delTATG占总检出致病性变异的52.63%（10/19），c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占总检出致病性变异的10.53%。4个常见致病性变异占总检出致病性变异的84.21%（16/19），4个常见致病性变异和2个次常见致病性变异占总检出致病性变异的94.73%。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件对数据进行分析。计数资料用百分比表示，组间两两比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 一般资料 共30例未明原因婴儿肝内胆汁淤积症患儿纳入本研究，其中男18例，女12例。除1例患儿父母为近亲婚配外，其余所有患儿的父母均非近亲。其中29例患儿进行了血氨基酸质谱检测，发现8例瓜氨酸升高伴或者不伴其他氨基酸升高（如甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸），3例甲硫氨酸升高，1例酪氨酸升高，另外17例未见明显氨基酸代谢异常。

1.2.3 判读方法：测序结果利用SeqScape 2.0软件进行分析，然后利用DNAMAN5.1.5软件（LynnonBiosof，美国）与SLC25A13基因序列（Ensembl Genome Browser：ENSG0000004864）进行比对。变异类型根据人类基因组变异学会（http://varnomen.hgvs.org/）标准进行命名。致病性分析根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）发布的序列变异的解释标准指南进行[5]。SLC25A13基因Ensembl参考序列为ENSG00000004864，Genbank参考序列为NM_014251.3。编码的氨基酸Ensembl参考序列为ENSP00000265631.1，Genbank参考序列为NP_055066.1。检测到的变异通过检索PubMed、HGMD、ClinVar等在线数据库进行比对。已知的致病性变异、经典剪接位点变异、无义和框移变异均被认为是致病的。对新发的错义变异分别进行人群变异频率分析、氨基酸同源性分析、变异功能预测分析等，以确定其致病性。

2.4 瓜氨酸代谢异常与基因谱的相关性 在12例检测到SLC25A13基因变异的患儿中，共8例入选瓜氨酸血症组，3例入选非瓜氨酸血症组。另外1例由于血氨基酸检测时患儿胆汁淤积症已完全缓解，转氨酶恢复正常，参考意义不大，故不适合入组分析。对比瓜氨酸血症组和非瓜氨酸血症组中的基因变异类型，发现2组基本以非错义变异为主，基因变异类型差异无统计学意义（P＞0.05）；比较2组间等位基因变异数量，发现瓜氨酸血症组中等位基因变异的数量显著高于非瓜氨酸血症组，差异有统计学意义（P=0.001）。

美国、加拿大、澳大利亚等国制定并完善了矿业生态补偿相关措施。例如美国的“湿地融资计划”，澳大利亚的“环境净收益计划”，加拿大要求矿业主与政府签署“损益协议书”，做好利益分配和生态补偿[13]。同时还着重对废弃矿山进行改造，发展矿山公园和矿业旅游。

国家政府应该加大对女性就业的政策帮扶，通过政治手段和法律手段规范就业体制，完善对女性就业的权益保护；社会要发挥媒体的宣传效应，加大对女性就业的正面宣传，引导女大学毕业生更加自信更加清楚的面对社会客观形式，提高自身能力，保持清醒的意识，客观择业。各应聘单位一定要客观公平公正公开的进行合法招聘，避免性别歧视和人为设置“就业壁垒”，根据理工科女大学毕业生的特点为她们设定一批能够发挥她们自身最大商业价值的竞聘岗位。

2 结果

证明 定义如下：对任意x ∈ X, = (x → 1) → 1).首先证明是X的犹豫模糊滤子.显然， ⊇ 对任意x ∈ X都成立，即(HF1)成立.对任意x,y ∈ X, 由命题1.1和引理2.1知，

1.2.2 热点变异c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的检测：①位点c.1638_1660dup23bp：这是一段23 bp序列的重复，在该位点的两端设计引物（F：CAGGAGAGGCATGGTTGCATTTCCC；R：GACTTAC GAATTGCTACAGCGATGG），PCR片段长度为480 bp，用普通PCR进行扩增再送去一代测序即可。目标区域序列为GAGATTACAGGTGGCTGCCCGGG，如样本没有出现23 bp的重复，判定为野生型（negative），反之则为变异型（positive）。②位点IVS16ins3kb：这是一段3 kb的片段插入变异，在该位点的两端设计引物（F：GGAGCAGACATCTTGCACAC；R：TGATGAGAATG TATCAACTCC），如果有插入，PCR之后会出现大于 3 kb的条带；如果没有插入，结果只有703 bp的条带。为了确认这一结果，再对PCR产物片段偏大的样本进行一代测序，如果样本出现了3 kb的碱基插入，判定为变异型（positive）。

企业在资金使用的过程中，需要进行严格的科学论证，不能盲目扩大规模，防止资金断流，让企业陷入经营困境。对于中小型餐饮企业而言，提升企业自身经营实力，发展品牌效益，是企业可持续发展的一个关键因素。

不错，简东亮是李若的房东，当初李若到广州来打拼的时候，发现房租贵得要命，她绕来绕去地找朋友，就租到了简东亮的房子。他贷款买的50平的两居室，月供要还20年，路漫漫其修远兮，出租个房间给李若也是为了缓解一下房贷压力。

3 讨论

SLC25A13基因变异所致NICCD在新生儿期及婴儿早期常表现为血氨基酸异常，尤其以瓜氨酸血症为最典型[6-7]。通常为了提高SLC25A13基因变异筛查效益，多以血氨基酸明显异常作为主要筛选指标，进行高频致病性变异的筛查[2，6，8-9]。本研究中在8例存在明显瓜氨酸血症的病例中均检测到存在SLC25A13基因变异，可见瓜氨酸血症在NICCD病例中具有高度特征性，是临床识别NICCD的重要指标，与既往研究[6]一致。本研究中3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患儿均未检出到SLC25A13基因变异，与既往研究[6]不一致。另外，本研究中4例虽然不存在血氨基酸代谢异常，仍检出SLC25A13基因变异，提示对于临床不存在氨基酸代谢异常的胆汁淤积病例需要保持警惕，要考虑NICCD的可能性，以免发生漏诊，延误诊治。另外，本研究发现瓜氨酸血症患儿中等位基因变异的数量明显高于非瓜氨酸血症患儿，提示等位基因变异数量越多对Citrin蛋白功能影响越大，故越易导致临床上出现瓜氨酸血症。近几年，多个研究[6，10-12]表明， 虽然瓜氨酸血症在NICCD中具有特征性，但是在新生儿期以及婴儿期仍然存在血氨基酸代谢筛查阴性的NICCD患儿，这部分病例容易误诊、漏诊，对于缺乏典型临床表现的病例，需考虑采用NGS进行基因检测。

研究发现日本最常见的致病性变异类型是c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[13]，而韩国人群中最常见的致病性变异类型是IVSl6ins3kb、c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[14]。LIN等[10]报道的中国人群中最常见致病性变异为：c.852_855delTATG（58.33%）、IVSl6ins3kb（10.04%）、c.1638_1660dup（8.52%）、c.615+5G＞A（7.58%），且存在地区差异，c.852_855delTATG在南方高，北方低，而IVSl6ins3kb在南方低，北方高。基因变异的地区差异可能与人种迁移及祖先来源有关。本研究先证者中检出的变异类型中，以4种高频变异最常见，其中c.852_855delTATG占总检出变异的52.63%，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占总检出变异的10.53%，与LIN等[10]的研究相一致，本研究中的病例来源于温州，温州地处浙南地区，位于北回归线以南，变异特征与地理区域分布相吻合。国内报道了多个不同地区关于SLC25A13基因变异研究，从中国北部到中国南部，从中国东部到中国西部，c.852_855delTATG变异在总变异中的频率为46.57%～58.33%，可以看到该变异占绝对优势，近半数的病例携带c.852_855delTATG变异。LU等[13]报道中国正常人群中c.852_855delTATG等位基因携带率为1.08%（45/4169），对于我国庞大的人口基数来说，c.852_855delTATG变异位点携带者数量相当可观，需要重视，尤其是有关优生优育方面，减少或避免遗传代谢病婴儿的出生。

本研究是温州地区，乃至浙江地区首个CD的队列研究，SLC25A13基因变异总检出率为40%，提示Citrin缺陷是婴儿肝内胆汁淤积症中的重要病因，亦是婴儿肝内胆汁淤积症中居首位的遗传性代谢性病因。随着对CD的认识逐步加深，研究的进一步深入，新发变异逐步被发现。本研究检测到一个新发变异c.1808T＞C，p.L603P，该变异位点为罕见变异位点，变异功能预测分析提示为致病性变异，新变异的发现丰富了SLC25A13基因变异谱。以上发现为NICCD确诊提供了可靠依据，也为相应家庭的遗传咨询和产前诊断提供了科学依据。

本研究的不足之处在于3例患儿存在SLC25A13基因单个杂合变异，且未提示存在明显瓜氨酸血症，无法确诊NICCD。本研究仅对已知常见的大片段的插入或缺失变异进行检测，可能遗漏罕见、未报道到的，甚至是内含子区域的大片段的插入或缺失变异。另外，对于新发现的变异，仅进行变异功能预测，未进行体外功能研究，未来可以对新变异的功能改变进一步进行研究。

SLC25A13基因变异所致CD是未明显原因婴儿肝内胆汁淤积症中居首位的遗传代谢性病因，以c.852_855delTATG，p.M285Pfs*2为最常见变异类型。新发现的变异位点丰富了SLC25A13基因的变异谱。