脾酪氨酸激酶在肝脏疾病中的作用机制

乐滢玉， 张荣臻， 吴 聪， 肖伟松， 覃小宾， 曾胜澜， 毛德文

1 广西中医药大学 研究生学院， 南宁 530222； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是一种72 kD的胞质非受体酪氨酸激酶，是酪氨酸激酶中zeta-链相关蛋白激酶70/Syk家族的成员之一，其由两个SRC同源2结构域和一个C端酪氨酸激酶结构域组成[1]。Syk参与多种细胞类型的信号传导，在造血细胞中高度表达，包括肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、血小板、B淋巴细胞和未成熟T淋巴细胞，并在这些细胞的信号传导中发挥重要作用。Syk的异常调控与不同的变应性疾病、抗体介导的自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、哮喘、肾脏疾病、肝纤维化和变应性鼻炎)有关[2]。在免疫细胞中，Syk主要通过其串联SRC同源2结构域与免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosinebased activation motifs, ITAM)相互作用而发挥作用。在肥大细胞中，Syk通过高亲和力的IgE受体FcεRI(high affinity IgE receptor, FcεRI)介导下游信号传导，而在中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和血小板中，下游信号传导通过Igγ和FcγR(Fc gamma receptor, FcγR)受体介导[3]。由于Syk在B淋巴细胞和T淋巴细胞受体下游信号传导中发挥关键作用，因此在早期淋巴细胞发育中也扮演着重要角色[4]。Syk被激活后，调节下游信号传导，驱动先天免疫系统和适应性免疫系统的炎症通路。除在造血细胞中高度表达之外，研究[5]表明，Syk也在非造血细胞如成纤维细胞、上皮细胞、乳腺组织、肝细胞、神经元细胞和血管内皮细胞中表现出更广泛的表达模式。Syk在肝细胞中通过G蛋白偶联受体激活有丝分裂原活化蛋白激酶。除了与肝细胞有关，Syk还可以在肝巨噬细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)和肝窦内皮细胞中表达[6]。然而，关于Syk信号通路在肝病中的研究仍然有限。因此，本文重点讨论了Syk在常见肝脏疾病中的作用机制及其作为治疗的潜在靶点所面临的机遇和挑战，以期为肝脏疾病的治疗提供更好的思路和依据。

1 Syk的传导机制

Syk的免疫受体信号传导需要满足以下两个条件：Syk激酶活性，两个SRC同源2结构域。Syk激酶结构域在静止状态下保持非活性，但可以通过两个SRC同源2结构域与双磷酸化的ITAM相互作用而被激活。即使在没有磷酸化ITAM结合时，接头区域内的酪氨酸残基也可导致激酶活化[7]。Syk的SRC同源2结构域与磷酸化ITAM的结合是Syk激活和下游信号传导的关键步骤[8]。Syk既可以通过ITAM磷酸化，也能通过催化其接头酪氨酸的自磷酸化，促使Syk活化，因此在初始ITAM介导的Syk激活过程中可能存在正反馈机制。活化的Syk与大量下游信号传导效应因子结合，并通过影响转录因子的激活以及将其组装到转录复合物中来参与促炎基因的表达[9]。

2 Syk在肝脏疾病中的作用

2.1 Syk与肝纤维化 肝纤维化是由慢性肝损伤导致组织瘢痕形成和炎症的过程，可进一步发展为终末期肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[10]。进行性肝纤维化多由病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等疾病引起，以肝脏中细胞外基质过多沉积为特征。据统计，全球肝纤维化发病率高达1%～2%，每年因肝纤维化死亡人数超过100万[11-12]。HSC在细胞外基质沉积和肝脏纤维形成中发挥核心作用[13]。HSC通常是静息细胞，并作为类维生素A贮存细胞位于肝细胞和窦状内皮细胞之间的空隙(Disse空隙)[14]。肝损伤或微环境刺激激活静息的HSC，导致细胞外基质的产生和积累，引发肝纤维化[15]。此外，活化的HSC失去其类维生素A贮存功能，高度增殖并产生大量趋化因子和细胞因子，进一步增加了细胞外基质的产生[16]。

研究[6]表明，Syk在HSC激活中起关键作用，Syk抑制剂在动物纤维化模型(包括四氯化碳诱导的小鼠、二乙基亚硝胺诱导的大鼠和胆管结扎诱导的大鼠模型)中均能有效的阻断HSC活化，从而有效减弱动物模型中的肝纤维化和HCC的形成。同时，抑制Syk表达可显著降低纤维化相关基因(包括ACTA2、PDGFRβ、COL1A1)的mRNA和蛋白质表达。此外，Syk存在两个主要同工型Syk(L)和Syk(S)，其均在肝纤维化和HCC的发展中起着不同的作用。Syk(L)和Syk(S)mRNA在大鼠肝纤维化进程中表达均得到增强，其中Syk(L)的表达水平在肝纤维化中起主要作用，而Syk (S)与肿瘤发生、HCC侵袭和转移更为相关。据报道[17]，特定转录因子的选择性表达对HSC的激活至关重要。Qu等[6]研究表明，Syk通过调节特定转录因子(MYB原癌基因转录因子、CREB结合蛋白和MYC原癌基因转录因子)的表达以及与HSC增殖相关基因(MYC和CCND1)的表达来进一步促进HSC活化。

2.2 Syk与病毒性肝炎 近期研究[6,18]发现，Syk在HBV和HCV感染的慢性肝损伤患者的肝组织中高度表达，从而诱导HSC的激活和肝纤维化的发生。此外，一项关于HCV相关型HCC患者的基因表达谱的研究[19]表明，Syk是180个上调基因中上调幅度最大的基因之一。

HCV感染还与冰球蛋白血症(B淋巴细胞增生性疾病)有关。CD81(cluster of differentiation 81，也被称为TAPA1)是控制B淋巴细胞增殖的抗体的靶点。CD81是HCV侵入的关键受体，与HCV包膜蛋白E2相结合会诱导Syk的激活，从而导致ezrin和radixin磷酸化[20-21]。因此，Ezrin、radixin蛋白和Syk是肝细胞中HCV感染的重要调控因子和治疗靶点[20]。此外，在HCV感染患者的肝细胞质膜附近观察到Syk的表达[22]。研究[23]表明，HCV非结构蛋白5A的N末端部分(aa 1-175)以及中央部分(氨基酸237-302)参与了与Syk的物理相互作用，抑制Syk的酶活性；此外非结构蛋白5A抑制了Syk介导的磷脂酶C-γ1的磷酸化，因此，促进HCV感染肝细胞的恶性转化，并参与肝细胞的癌变。上述研究显示，在HCV-CD81相互作用前阻断Syk激活以及调节HCV在靶细胞内的进入和转运为拓展抗HCV疗法提供了新的思路与策略。

2.3 Syk与酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD) ALD是指长期过量饮酒导致的肝脏疾病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和HCC。目前我国尚缺乏对ALD的流行病学调查，但据世界卫生组织2018年的报告[24]，全世界每年约有300万人死于酒精滥用，其中ALD占死亡人数的绝大部分。ALD的发病机制复杂，影响因素繁多，包括乙醇介导的肝损伤、氧化应激、肝细胞损伤引发炎症反应、肠道通透性和微生物群组的改变[25]。酒精及其代谢产物产生活性氧，通过线粒体损伤和内质网应激诱导肝细胞损伤[26-27]。受损的肝细胞释放促炎细胞因子和趋化因子，导致免疫细胞的募集和激活。参与ALD进展的核心细胞类型是巨噬细胞，巨噬细胞通过刺激免疫细胞的浸润和Kupffer细胞(常驻肝巨噬细胞)的激活，在诱导肝脏炎症中发挥重要作用[25,28]。在ALD患者中，肝脏中的常驻和募集巨噬细胞被细菌内毒素(lipopolysaccharide, LPS)调控的Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)信号通路激活，由于过量饮酒后肠道通透性增加，导致门静脉和体循环中的LPS升高[29-30]。Syk在TLR4信号传导中也发挥着重要作用，中性粒细胞、单核细胞中的Syk磷酸化与TNFα、单核细胞趋化因子1等促炎细胞因子的分泌有关[31]。Zhou等[31]研究显示，受损肝细胞释放的内源性微粒配体剪接体相关蛋白130是一种危险信号因子，其与LPS协同驱动肝脏炎症反应。

已有研究[32]证明，酒精性肝炎患者肝脏中Syk表达和磷酸化水平增加。Syk通过肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAF)家族成员相关的NF-κB激活剂结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)或干扰素调节因子3(interferon regulating factor 3, IRF3)信号来调节肝细胞死亡。Syk抑制剂可显著降低肝脏磷酸化TBK1和磷酸化IRF3水平，减少促炎细胞因子的分泌，从而改善酒精引起的肝损伤和细胞死亡[33]。同时，Syk在脂质积累中也扮演着重要角色，使用Syk抑制剂治疗可通过抑制脂质生物生成和促进脂质代谢来预防及改善酒精诱导的肝脂肪变性[34]。ALD患者肝脏中循环血单核细胞和外周血单核细胞的总Syk以及活化的Syk(pSykY525/526)表达显著增加。由于Syk与ALD的发病机制密切相关，并且Syk可作为酒精性肝损伤的主要信号分子，因此，Syk抑制可以预防和减弱酒精性肝脏炎症、细胞死亡、脂肪变性等ALD的各个阶段。

2.4 Syk与非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指包括单纯性脂肪肝、NASH、肝纤维化和HCC的一系列不同程度的肝损伤[35]。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，NAFLD的发病率呈逐年上升的趋势，全球发病率约为25.2%，亚洲发病率高达27%，发病率随地区和社会条件的差异而略有变化(22.1%～28.6%)[36]。NASH是NAFLD更为严重和具有临床意义的阶段，临床表现为肝细胞损伤、脂肪变性和炎症，极易发展为终末期肝病和HCC[37]。

NASH的进展与TLR和核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide oligomeric domain-like receptors, NLR)等危险信号的逐渐积累有关[38]。LPS与TLR4的相互作用在具有炎症响应的先天免疫与和Kupffer细胞激活之间起着重要作用[39]。在NASH发展过程中，活化的Kupffer细胞产生的炎症细胞因子IL-1β、IL-6和趋化因子CCL2、FcγR1有助于循环血单核细胞与巨噬细胞进入炎症性肝脏。同时，活化的Kupffer细胞还分泌TNFα和TNF相关的凋亡诱导配体，诱导邻近肝细胞参与炎症反应和细胞凋亡，诱发和促进NASH发生发展[40]。

TRAF-6是多种信号通路中的共享分子，并通过适配器MyD88和IRAK-1(IL1受体相关激酶1)与TLR4相互作用。Syk通过与TRAF-6的关联，在IL-1诱导的趋化因子释放中发挥作用。TLR4通过B淋巴细胞受体传导信号诱导Syk活化，并对B淋巴细胞存活、增殖和B淋巴细胞受体介导的免疫应答至关重要[41]。T淋巴细胞和B淋巴细胞参与NASH的进展，暗示了Syk在这一过程中的作用。

研究[32]表明，相比于正常肝脏，NASH患者肝脏中Syk表达与NAS评分(NAFLD活性评分)升高呈正相关。Syk通过模式识别受体途径和NLR途径参与NASH的发病，而部分NLR在炎性小体的形成中起关键作用。核苷酸结合寡聚化结构域富含脓素亮氨酸重复序列结构域3炎症小体激活需要Syk参与，并形成炎症小体复合物[42]。因此，核苷酸结合寡聚化结构域富含脓素亮氨酸重复序列结构域3炎症小体的体内药理抑制作用可以减轻NASH的肝脏炎症、肝细胞损伤和肝纤维化程度[32,43]。

2.5 Syk与HCC 肝细胞凋亡和代偿性增殖是HCC发生发展的关键驱动因素，而Syk在HCC的发生发展中扮演重要角色。研究[44]表明，肠道菌群、LPS以及TLR4的信号传导与慢性损伤性肝脏炎症和癌变有关，肠道菌群的LPS通过激活TLR4可以促进损伤和炎症驱动的肿瘤生长，LPS-TLR4途径可通过增加非骨髓源性常驻肝细胞中的增殖和抗凋亡信号来促进HCC，而Syk通过参与调节LPS-TLR4途径之间的相互作用来影响HCC的发生发展。Yuan等[45]研究发现，HCC肿瘤组织中存在27%Syk基因被甲基化，Syk基因甲基化与Syk mRNA或蛋白表达的缺失高度相关，并在基因沉默中起因果作用。Syk甲基化和表达的缺失有助于肝癌的发展，并且是HCC患者总生存率的预测指标。此外，在HCC细胞中发现Syk启动子的甲基化是负向调控的。在Syk沉默的HCC细胞系中恢复Syk表达可降低肝细胞的生长、细胞迁移和侵袭，但有助于细胞与基质的黏附[46-47]。

Checkpoint激酶1(Checkpoint kinase 1, CHK1)是一种进化保守的Ser/Thr激酶，在DNA损害后变得活跃。研究[48]表明，CHK1的高表达具有致癌作用，并与HCC患者的不良预后有关。CHK1能够使肿瘤抑制因子Syk(L)在Ser295位点发生磷酸化，并诱导其蛋白酶体降解，从而促进HCC的发生发展。但是，Syk(L)的非磷酸化突变体可抑制HCC细胞系的增殖、集落形成和肿瘤生长。因此，在HCC患者中CHK1和Syk(L)的表达水平呈明显的负相关。有趣的是，另一研究[49]发现，Syk(L)和Syk(S)在对抗HCC侵袭和转移方面具有相反的调节作用。Syk(S)会促进肿瘤生长和转移，抑制细胞凋亡，并对抗Syk(L)的相反作用。而Syk(L)可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。同时，Syk(L)表达水平上调或Syk(S)表达水平下调对HCC患者3年和5年的复发时间以及总体生存曲线明显延长，使肝癌切除术后患者的肿瘤早期复发率明显下降。因此，Syk(L)和Syk(S)的表达水平是HCC患者预后的有力预测指标。

3 Syk抑制剂

近年来，Syk信号通路已被认为是各种疾病新兴的治疗靶标，尤其是在肝脏疾病。Syk抑制剂的研究亦得到社会广泛的关注，并且有部分药物已进入动物实验及临床研究，疗效可观。研究[32-33]表明，R406可阻断Fc受体信号通路及NF-κB信号通路、抑制炎性小体激活、减少巨噬细胞和其他肝细胞中Syk的表达和磷酸化，最终达到抑制脂肪变性、炎症和纤维化，改善非酒精性和酒精性脂肪性肝炎。GS-9973是一种新型的口服Syk抑制剂，通过抑制Syk的Y525/526磷酸化，降低HSC活化因子(MYB原癌基因转录因子、CREB结合蛋白和MYC原癌基因转录因子)和HSC增殖因子(MYC、CCND1)的表达水平，抑制造血干细胞增殖和活化，最终起到抗肝纤维化和抗癌作用[6]。PRT062607和Piceatannol两种抑制剂可导致肿瘤内p16和p53表达水平升高而使抗凋亡蛋白Bcl-xL及SMAD4表达水平降低。此外，还能影响肝脏中有关细胞凋亡和细胞衰老的基因表达，抑制雷帕霉素靶蛋白、IL-8信号转导和氧化磷酸化。最终选择性地阻断Syk磷酸化、显著减少炎症细胞浸润和HSC分化，抑制肝纤维化及肝癌的发展进程[50]。尽管Syk抑制剂现已在动物实验和临床研究中取得不错的疗效，但仍然存在着一些问题尚未解决;(1)长期安全性尚未得到证实;(2)Syk在不同细胞中普遍表达，Syk抑制剂对多种细胞功能的全面抑制可能会产生副作用；(3)目前，关于Syk抑制剂的研究多停留在动物实验研究，要转化为临床疗效，仍尚需进一步大量的研究。因此，如何在不破坏细胞生理功能的情况下抑制病理过程是Syk抑制剂广泛应用于临床的主要挑战之一。

4 小结

综上所述，Syk作为一种新型的潜在治疗靶点，其与慢性肝脏疾病的发生发展密切相关。明确Syk在慢性肝脏疾病中具体的作用机制，有利于新型药物的开发，并为肝脏疾病的治疗提供新策略和新思路。虽然近年来有关Syk对肝脏疾病作用的研究较多，一些小分子Syk抑制剂在试验研究中取得不错的成绩，但仍存在长期安全性以及临床疗效的不确定性等许多尚未阐明的关键问题，故尚需对该领域进一步深入探索，为肝脏疾病的临床防治提供新的策略和实验支撑。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：毛德文、乐滢玉负责研究选题；张荣臻、吴聪、肖伟松负责设计论文框架，起草论文；毛德文、乐滢玉负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿；覃小宾、曾胜澜负责修订论文。