蓝莓及其提取物中花青素检测方法的研究

陈子凡，董 莹，何思东，刘 康，吴丽娟，黄 浩

1.河源市食品检验所 (河源 517000) 2.黄埔海关技术中心 (广州 510700) 3.河源市工业和信息化局 (河源 517000) 4.河源海关 (河源 517000)

蓝莓含有儿茶素、绿原酸、花青素等营养物质[1]，具有抗癌、保护心血管、保护肝脏、预防近视等作用[2-4]。从2003年起至今，以蓝莓为原辅料登记保健食品有98种，配方中的功效物质均以花青素为主，随着蓝莓花青素的保健功效被群众所日渐认可，蓝莓产品的市场会越来越广阔[5-6]。本文通过查找和收集国内外相关文献，对蓝莓花青素检测技术的发展和现状进行分析，为蓝莓中花青素检测技术的开发和制标提供参考。

1 蓝莓花青素成分概述

花青素，属于水溶性植物色素，基本结构为黄鎓盐阳离子结合物。蓝莓主要含有矢车菊素、飞燕草素、锦葵素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素6种[7]，但由于结构不稳定，花青素在蓝莓中以糖苷类物质存在[8]，这些糖苷类物质通常由花青素和1个或多个葡萄糖、芸香糖等糖结合而成[9]。

2 检测技术的研究

蓝莓花青素检测方法主要有pH值示差法、分光法、色谱法、质谱法。其中pH值示差法、分光法只能检测花青素总含量，色谱法可测定花青素类物质的种类和含量，而质谱法则可以检测到花青素糖苷的种类和含量。本文也列举两种类似蓝莓产品检测花青素的质谱方法作为参考。

2.1 pH值示差法

pH值示差法采用光度计于510 nm和710 nm处检测吸光值，计算可得花青素的总含量，具有操作简便、成本低廉的优点。

张荣菲等[10]通过正交试验，分析了60%乙醇中盐酸含量、超声提取时间、料液比和超声提取水浴温度，发现60%的乙醇-0.2%盐酸溶液对蓝莓果实中花青素提取效果影响最大，在该提取条件下使用pH值示差法检测蓝莓果实中的花青素，测得蓝莓果实的花青素含量为1.91 mg/g。叶红玲等[11]通过正交试验，确定提取蓝莓果渣中花青素的最佳工艺条件是选用pH值2.5的70%乙醇水溶液、超声波功率200 W下每提取2 s停4 s的间歇，料液比(g/mL)1∶30、30 ℃超声20 min，最终测得果渣的花青素含量为9.99 mg/g。张星[12]等采用1 mL蓝莓试供液分别与9 mL pH 1.0的KCl缓冲液和9 mL pH 4.5的NaAc缓冲液混合，静置15 min后检测510 nm和700 nm下的吸光度，并以蒸馏水为空白，测得蓝莓提取液中花青素含量为160.30 mg/100 g。

2.2 分光法

分光法是在520～540 nm波长之间进行扫描，获得特征峰，利用标准对照品确定花青素的百分比含量。T/CCCMHPIE 1.25-2016中[13]，称取15～20 mg越橘提取物样品用60 mL 2%盐酸-甲醇溶液在80 ℃水浴中回流水解0.5 h，然后过滤，以2%盐酸-甲醇作空白，在540 nm吸收波长下对花青素进行检测。该方法测得花青素含量以飞燕草素计，数值以百分比含量%表示。

曾荣华等[14]参照T/CCCMHPIE 1.25—2016，称取样品50 mg，加入30 mL 2%盐酸甲醇溶液进行超声提取，冷却后用2%盐酸甲醇溶液定容，稀释后以2%盐酸甲醇溶液作为空白，在540 nm处测量吸光度，测得蓝莓样液的花青素含量为25.4%。

2.3 色谱法(LC)

LC法是在加温下将花青素苷类物质转变成花青素，使用紫外检测器或二极管阵列检测器检测可测得花青素的种类和含量。

NY/T 2640—2014标准，取匀浆后的蓝莓样品1～10 g，用25%盐酸-乙醇水溶液定容至50 mL，超声提取30 min后于沸水浴中水解1 h，静置后取上清液过0.45 μm水相滤膜，使用UV或DAD检测器检测，该方法的检出限在0.15～1.50 mg/kg之间[15]。

T/CCCMHPIE 1.25—2016中[13]，称取125 mg样品加入25 mL容量瓶中，用2%盐酸-甲醇溶液定容，移取溶液用10%磷酸水溶液定容，过0.45 μm滤膜后在高效液相色谱上用外标法定量。

陈海龙等[16]考虑到蓝莓花青素常用的萃取液为有毒的甲醇和乙醇，研究使用食用有机酸作为提取溶剂。称取2 g打浆蓝莓，加入30%柠檬酸溶液，超声30 min，以10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm有机膜，利用高效液相色谱法检测，该方法的精密度RSD为1.36%，最低检出限为0.06 mg/kg，加标回收率为98.28%。

王欢等[17]通过对检测波长、水解温度、水解时间的研究，采用了称取1～5 g样品，用盐酸-乙醇-水(1∶2∶1)提取液定容至25 mL，超声提取30 min，然后在120 ℃烘箱中水解60 min，再统一采用HPLC在525 nm检测波长处对6种花青素进行检测。该方法的花青素回收率在80.50%～108.80%。

王馨悦[18]将样品粉碎匀浆后，以1∶10的料液比加入52%乙醇，以469 W微波提取4 min，提取液于3 500 r/min离心5 min后取上清液减压浓缩，冷冻干燥后制成浸膏备用。检测时，用纯净水复溶稀释后过0.45 μm水相滤膜上机测试。该方法的共有峰面积RSD值为1.12%～2.62%，保留时间RSD值为0.14%～0.31%。

Matthew Hynes[19]等使用30 mL的乙腈-0.3%磷酸水溶液(80∶20)作为萃取液，将0.3 g蓝莓均质1.5 min，最后以2 500 r/min离心10 min，取2 mL上清液和200 μL浓盐酸混合，放入具有自封隔膜的玻璃瓶中，涡旋后放入150 ℃的烘箱中水解30 min。30 min后，取出玻璃瓶放入0℃的冰箱中10 min，以停止水解。从冰箱取出样品后，恢复至室温，立即过0.45 μm滤膜，上机分析。结果显示曲线R2值在0.988～0.992之间，6种花青素能在2分钟能完全出峰。

Pranathi[20]等称取0.125 g样品，采用了1 mL的2%甲酸-甲醇溶液作为提取液，旋涡搅拌溶解，再加入4 mL 10%磷酸溶液，分析前，使用0.2 μm醋酸纤维素滤膜过滤样品。结果显示曲线R2值在0.999 1～0.999 8之间，检测低限在0.10～1.56 μg/mL之间。

2.4 质谱法(MS)

采用MS法无需将花青素糖苷水解和提纯等前处理，降低了花青素的损失，可以测得花青素苷类物质种类及含量。

韩雪[21]等称取2 g蓝莓果泥，按1∶15(g/mL)加入50%甲醇水，在80 ℃下回流提取1 h，将提取液于8 000 r/min下离心10 min，上清液用0.25 μm滤膜过滤，使用飞行时间质谱仪(TOFMS)分析，在6种蓝莓果实中鉴定出13种的花青素糖苷。

岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心[22]采用称取10 g样品用20 mL 80%甲醇溶液超声提取15 min、9 000 r/min离心5 min，重复提取2次，合并定容至50 mL，过0.22 μm膜后使用三重四极杆质谱仪(QQQ)检测花青素苷含量，该方法在0.1～2.0 mg/kg范围内建立校准曲线，相对标准偏差在0.69%～5.13%之间，花青素苷的最低检出限量在0.000 3～0.028 9 μg/mL。

张协光[23]等称取1 g粉碎后的样品用5%甲酸-甲醇溶液定容，超声提取30 min，再次定容后离心，过0.22 μm滤膜后上线性离子阱质谱仪(LITMS)检测，建立了可以同时6种花青素苷和6种花青素的方法，结果表明在0.042 4～19.9 μg/mL范围内线性良好，回收率为61.9%～112.7%，方法的检出限在1.73～8.10 ng/mL。

2.5 其它方法

本次研究也发现类似蓝莓的产品采用了一些可供参考的质谱方法，这些方法可以快速检测花青素苷类物质的含量，前处理更为简便快捷。

夏碧琪[24]等采用亲水作用色谱(HILIC)串联质谱仪检测葡萄酒中的4种花青素，葡萄酒试供品用甲醇稀释1 000倍后，无需其他前处理，过0.22 μm滤膜后，上机分析。该方法的线性范围在1.0～50.0 ng/mL间，R值高于0.999 2，方法定量限为0.05～1.00 ng/mL。

王海敬[25]等采用甲酸-甲醇(1∶9)溶液为溶剂，加入内标物后进行液液萃取，在4 ℃条件下提取12 h后，4 000 r/min离心取上清液上机，使用四级杆飞行时间质谱(QTOF)对番茄提取物进行检测，同时检测12种花青素，在线性范围在1～1 000 μg/mL，定量限<1 μg/mL。

3 结论与展望

综上所述，pH值示差法和分光法，主要适用于花青素的总量检测，广泛应用于蓝莓和蓝莓产品的质量鉴别、蓝莓花青素含量的快速检测。液相色谱法可以对蓝莓的花青素种类进行定性和定量，有助于分析蓝莓产品在花青素的分离提纯时效果各种花青素在抗氧化效果方面的所起的作用和原理。质谱仪法则直接检测蓝莓中的花青素的糖苷物质。为选育蓝莓品种提供参考，揭示花青素苷在药品中构效关系及作用机制，以及花青素提取制备过程对天然色素结构特征和功能活性的影响。随着花青素检测技术的发展，建立蓝莓及其提取物中花青素和花青素苷的检测方法和标准，对提高蓝莓产品质量、保障消费者购买花青素产品质量、提高食品监管部门的检测能力都有重要意义。