QuEChERS结合LC-MS/MS法在粮谷有机污染物检测中的研究进展

蒋林惠，周易枚，陈 煜，袁琛凯，陈 彬

南通市食品药品监督检验中心 (南通 226000)

农药残留和真菌毒素是可能污染粮谷的两类有害物质。近年来粮食卫生检查、食品监督抽查、食品安全风险监测等项目中，农药残留和真菌毒素已经成为重点监测对象。但由于农药残留和真菌毒素的品种极多，使检验工作量严重增加，尤其对大批量样品检查，检验效率明显降低。故而开发高通量的多重污染检测技术变得十分重要。

使用化学农药，虽在控制农作物病虫害发生以及保障粮食、经济作物持续稳产丰收等方面，做出了突出贡献[1]，但农作物可能由此受到严重污染，再加上工业三废对水体土壤的污染，从而使得对粮谷的污染残留监控变得尤为重要。而粮谷的储藏加工过程中，由于空气潮湿或储藏不善，易遭受各种霉菌的侵害，霉菌的生长繁殖会产生多种有毒代谢产物，进而造成各种各样真菌毒素的污染[2]。据不完全统计，全世界每年大约有25%的农产品被真菌毒素污染，约有2%的农作物因污染严重而失去经济和营养价值，造成的损失高达数百亿美元。中国作为粮食作物的主要产国之一，真菌毒素污染也造成了严重的经济损失[3]。

粮谷中农药残留物主要采用色谱法，包括气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用法及液质联用等技术，往往需要较为复杂的样品提取和净化等前处理过程。真菌毒素的检测则是大多数先采用免疫亲和层析提取、净化后，再采用高效液相色谱法紫外、荧光检测或质谱检测[4]。这些检测方案所需的时间成本和试剂成本较高，操作繁琐。随着检验检测技术的发展，多种快速前处理方案的发布帮助有机污染物的检测往便捷、高效的方向发展，QuEChERS快速样品前处理技术(QuEChERS：Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年来发展较快、应用较多的技术之一。先进的检测技术不仅能提高工作效率，节约资源，也是最终能为食品安全保驾护航[5]。

本文介绍QuEChERS结合液质联用法近年来在粮谷有机污染物检测中的应用，对其在实际应用过程中发现的问题进行了分析归类，提出进行方法优化的思路，并展望其在粮谷有机污染物检测中的应用和发展。

1 QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法在农药残留检测中的应用

粮食作物生长过程中易遭受各种病害、虫害和草害，为提高农作物产量，保证粮食生产安全，需要在不同的生长阶段喷施农药。但若农药使用不当则会导致成品粮中农药残留过多，危害粮谷的食用安全。为快速了解粮谷中农药残留的实际情况，开发快速、准确的农药残留提取、净化与检测技术具有重要意义。目前，QuEChERS法已在农药多残留的检测中得到了广泛应用[6]。近年来，新仪器新技术的协同发展，使得QuEChERS法提取食品中农药残留的回收率不断提高，同时提取的农药残留品种不断增加，检测限和定量限也逐渐降低。

陈溪[7]研究了大米205种农残的快速提取，LC-Q-TRAP/MS测定方案。实验取大米粉5 g，加10 mL水[8]，15 mL乙腈(含0.1%乙酸)，6 g MgSO4、1.5 g NaCl，上清液8 mL，1200 mg无水硫酸镁，400 mg C18和400 mg PSA吸附剂，上清液过0.2 μm滤膜，LC-Q-TRAP/MS测定。205种农药在添加水平为10 μg/kg时的平均回收率范围为62.4%～127.1%，相对标准偏差(RSD)范围1.9%～20.0%；添加水平为50 μg/kg时，平均回收率范围为65.9%～120.3%，RSD范围1.0%～18.4%。检测大米中205种农药的定量限均低于10 μg/kg，其中176种农药的定量限为0.5 μg/kg，3种农药的定量限为5 μg/kg，11种农药的定量限为2.5 μg/kg，2种农药的定量限为1.25 μg/kg，13种农药的定量限为10.0 μg/kg，满足我国、韩国、日本、欧盟等国家大米中农药最大残留限量(MRLs)的要求。

张利明等[9]进行了QuEChERS-LC-MS/MS实验，针对稻谷生产中使用的农药种类，大米样品5 g大米经10 mL乙腈提取，加3 g氯化钠，氮吹浓缩至2 mL，过滤膜，利用LC-MS/MS的多反应监测模式进行测定。结果表明：目标化合物线性关系良好，R2>0.996，在5、10、50、200 μg/kg 4个添加水平下，加标回收率为80.1%～109.9%，相对标准偏差为1.1%～13.5%。卢兰香等[10]称取适量试样(黄瓜10 g、大米5 g、茶叶2 g)，加入10 mL水(大米和茶叶加水，黄瓜不加水)，涡旋混匀，加乙腈20 mL，加入醋酸钠提取盐，取上层提取液到15 mL PSA/C18净化管中。取上清液10 mL，45 ℃氮吹浓缩至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸水(1∶1，v/v)复溶，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后上机测定。该方法中吡虫啉在0.05～10.0 μg/mL范围内线性关系良好(R2≥0.999)，平均回收率在88.3%～109.1%之间，相对标准偏差不大于3.5%。

上述研究发现，进行粮谷中农药残留检测时，多采用含有有机酸的乙腈溶液进行初次提取，再加入盐析剂(多为硫酸镁、氯化钠或醋酸钠)以期提高萃取效率，净化试剂主要为单一组分C18、PSA、无水硫酸镁或其多组分混合物。色谱柱选择质谱专用C18柱即可，目标物进行LC-MS/MS多反应监测方式扫描定量[11-12]。该类研究方案均能获得较为满意的检出限、回收率、相对标准偏差，其指定浓度范围的线性关系良好。本文提及的研究对于提取液、盐析剂、净化剂各持己见，但这其中有几处关键点需要注意，比如提取液的比例(乙腈、水、有机酸)、盐析剂及净化剂的品种及比例选择。

2 QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法在真菌毒素检测中的应用

粮谷类是受真菌毒素污染最严重的食品原料。近年来，由于气候、耕作制度和栽培措施的显著变化，导致真菌毒素对农产品的污染愈发严重。为了应对真菌毒素污染问题，许多国家和地区制定了粮食及其制品中真菌毒素的限量标准。同时，国内外研究者也对食品中真菌毒素的检测方法进行了深入的研究，研究目的主要集中在提高样品通量、缩短检测时间、降低检测限和提高准确性等[13-14]。

与农药残留相比，QuEChERS法在真菌毒素检测中的应用相对较少，这是由于受真菌毒素污染最严重的食品主要是谷物和豆类，而谷物和豆类与果蔬的基本组分差异较大。谷物和豆类中水分含量较低，同时糖类、蛋白质和脂类的含量远高于果蔬。此外，真菌毒素与谷物、豆类等物料组分的结合形式和果蔬中农药残留也有所不同。近年来，许多学者根据谷物和豆类的特性开发了许多基于QuEChERS法的真菌毒素检测方法。

陈慧菲等[15]经过研究用改良的QuEChERS方法进行提取，用超高效液相色谱串联质谱仪进行测定谷物中的8种真菌毒素。5 g样品，提取液16 mL 1%的乙酸乙腈，盐析剂6 g MgSO4、1.5 g NaCl，1 mL甲醇-乙酸铵溶液(1∶1，v/v)复溶，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。8种毒素的线性相关系数(R2)均不小于0.998，检出限0.3～1.0 μg/kg，加标回收率76.5%～113.4%，相对标准偏差为0.78%～5.03%。姜涛等[16]建立了玉米中共17种真菌毒素的测定方法，5 g样品，提取液25 mL含有1%甲酸的乙腈水(80∶20，v/v)，盐析剂3 g NaCl，上清液浓缩至1 mL，0.1 g C18净化，超高效液相色谱-串联质谱仪测定。线性相关系数(R2)均不小于0.994，检出限为0.1～20.0 μg/kg，加标回收率为70.76%～115.14%，相对标准偏差为2.21%～11.34%。肖全伟等[17]实现了小麦中8种真菌毒素的同时测定。2 g样品，8 mL 0.3%甲酸水溶液，10 mL乙腈提取，盐析剂1.5 g MgSO4、0.5 g NaCl，上清液2 mL，150 mg无水硫酸镁，150 mg C18和20 mg PSA吸附剂，提取液浓缩后20%乙腈水溶液溶解，液质联用仪测定。8种真菌毒素在小麦中线性良好，相关系数(r)均大于0.99，方法检出限0.10～1.0 μg/kg，样品平均加标回收率85.1%～95.4%，相对标准偏差3.8%～8.5%。

王丽娟等[18]进行粮谷中16种真菌毒素测定研究，5 g样品经20 mL乙腈-水-乙酸(84∶15∶1，v/v)溶液超声提取，盐析剂4 g无水MgSO4、1 g NaCl，提取液采用120 mg C18、600 mg MgSO4净化，净化液过0.22 μm微孔滤膜，用HPLC-MS/MS分析检测，结果能满足日常检测需求。Koesukwiwat等[19]采用研究利用QuEChERS法提取大米中的14种真菌毒素，所用提取溶剂为水-乙腈(10∶10，v/v)混合溶剂，盐析剂4 g MgSO4和1 g NaCl，8 mL上清液，加入1.2 g MgSO4、0.25 g C18、0.25 g中性氧化铝(Al-N)和0.4 g PSA净化，结果满意度高。

总结上述学者对于谷物中真菌毒素的检测方案：提取液中水的比例是提取效率的关键点，选择水、乙腈、有机酸三者的比例对于提高提取率十分重要；盐析剂的选择与农药残留提取相似；净化试剂则更为多样化，C18、PSA、中性氧化铝、MgSO4；浓缩后复溶试剂的选择十分重要(有机相种类、有机相比例、铵盐)，建议选择与初始流动相相一致的复溶试剂。

3 QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法在复合污染物检测中的应用

总结现有的QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法应用于粮谷类产品的实例，其多局限于农药残留或真菌毒素单类药物，使用QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法同时测定农兽药残留和真菌毒素的方法仍较少见。

赵健等[20]建立了同时测定大米10种真菌毒素和杀鼠剂的检测方法。大米样品2.5 g，使用10 mL乙腈-水-甲酸(体积比80∶19∶1)作为提取溶液，80 mg PSA净化，净化溶液经浓缩、复溶后，采用液质联用仪测定，外标法定量。结果表明：10种药物的线性范围为2～100 μg/L，线性关系良好(R2>0.99)，各药物的平均加标回收率在75.2%～110.0%，相对标准偏差在1.4%～10.7%，方法定量限在0.5～2.5 μg/kg，适用于大米中10种杀鼠剂和真菌毒素残留的同时快速定性定量分析。高璐斐[4]进行了小麦种污染物的专项研究，实验称取5 g样品，加入20 mL甲酸/水/乙腈(v/v/v，1∶14∶85)和少量的氯化钠以及4 g硫酸钠，提取上清液5 mL，装入0.1 g C18吸附剂，取上清液3 mL浓缩，加入500 μL甲醇/水(v/v，3∶2)混合液溶解，过0.22 μm滤膜，液质联用仪测定。采用本方法可以同时对14种小麦污染物进行定性定量测定，其线性方程相关系数R2均大于0.99；检测低限均在现有限量范围内；农药残留残留回收率在87%～103%之间，真菌毒素回收率在82%～96%之间。

同时提取测定多类有机污染物，所需考虑的因素相应增加，农药残留类物质与真菌毒素类在有些性质方面相差较远，如何选择一个合适的提取体系变得较为困难。粮谷类的特殊性质对于净化试剂也有特殊选择性，需根据实际样品进行筛选，净化试剂多选择单一品种，不再进行多成分组合。

4 结语

大量的研究发现进行粮谷中农药真菌毒素残留的高通量快速检测技术研究，从前处理的快速提取技术到目标物的仪器确认，其思路一脉相承。QuEChERS技术讲究快速、简单、低了价、高效、安全，其主要通过提取液提取、盐析剂萃取、净化试剂再净化三大步骤进行样品中目标物的富集。

各项研究中，提取液、盐析剂、净化剂得选择并不一致，有些研究甚至省略了净化步骤。这些方法虽然在已有研究中获得了较为满意得效果，但作为一种通用方案并不完善。笔者期望能够对已有得方法进行优化，建立一种适用于粮谷中多类别污染物的快速检测技术。进行粮谷中农药残留及真菌毒素的检测时，对以下几个方面提出优化建议。

(1)提取液。需特别注意粮谷样品蛋白质及糖类组分较高，提取和净化过程中易交联形成网络结构，提取液中加入一定比例的水，能浸润粮谷颗粒，增加有机溶剂对非水溶性基质的渗透性，提高目标物提取效果；有机相选择乙腈，因乙腈易于盐析、溶解农药、真菌毒素的能力较强，且萃取物中脂类物质的杂质含量较低；少量的甲酸能调节pH，并有效提取对于酸度、极性较为敏感的真菌毒素，并降低对碱敏感的农药或毒素的影响[21]。故而建议提取液选择乙腈∶水∶甲酸的混合溶液。

(2)盐析剂。MgSO4是促进液液分配的最佳选择，且可以增大极性组分的回收率，但会引入极性组分杂志；添加NaCl可以调节极性、减少极性杂质的干扰，但也会导致液液分配效果变差。在实际应用将MgSO4和NaCl混合使用，以获得最佳盐析效果。盐析剂选择MgSO4∶NaCl质量比为4∶1。

(3)净化试剂。C18对长链脂类物质、甾醇等非极性干扰物有良好的吸附效果。PSA能有效吸附糖类、脂肪酸、有机酸、脂类以及某些色素等，也易与酸性真菌毒素(OTA等)分子上羧基反应，影其回收率。净化试剂建议选择C18。

(4)复溶试剂。复溶试剂的选择需兼顾目标物的溶解能力及溶剂效应。建议选择初始流动相作为目标物的复溶试剂。

建立适用于粮谷中真菌毒素及农药残留的快速检测方案，达到高效，准确，高通量的目标，除上述关键点，可能还有其它方面，需要通过更深入的探索来加以完善。