色谱联用技术在中药及民族药物代谢组学研究中的应用进展

苏日古嘎，陈佳麟，徐 宁，王曦烨，许 良

(内蒙古民族大学 化学化工学院，内蒙古 通辽 028042)

代谢组学是研究生物系统对病理生理刺激或基因修饰的动态多参数反应的定量测量的学科，它主要研究细胞、体液、排泄物或器官匀浆中小分子有机代谢物的变化[1]。代谢组学分析技术主要有核磁共振、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、电泳-质谱联用及等离子体质谱等。色谱-质谱联用技术结合了色谱卓越的分离能力与质谱准确的定性定量优势，符合现代中药代谢组学分析的要求，已成为目前应用最广泛的分析技术[2]。气相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高，抗干扰能力强、重复性好、分析速度快、进样量少，且检测效果显著、分离效果好等优势，可用于分析组分复杂的血液样品。气相色谱-质谱联用技术继承了气相色谱分离效果好的特点，并兼顾了质谱仪专属性强的特点，可以在血液中干扰物质较多的情况下进行多组分分析[3]。样品在气相色谱-质谱联用技术分析前一般需要比较复杂的预处理步骤，包括样品纯化及衍生化，该法不适合分析热不稳定的代谢物[4]。而液相色谱-质谱联用技术分析方法对样品前处理方法并无过高要求，生物样品经蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取纯化富集后，可直接用于液相色谱-质谱联用技术检测分析[4]。液相色谱-质谱联用技术是代谢组学中用于定量分析内源性化合物的主要技术手段，具有分析时间短、完全自动化、所需样品制备量少等优点，适用于相对分子质量与极性范围广泛的内源性分析物[5]。本文综述气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)在中药及民族药代谢组学中的应用进展，以期为中药及民族药物的进一步研究提供参考。

1 色谱联用技术在药物代谢中的应用

1.1 GC-MS技术在中药代谢组学研究中的应用

气相色谱-质谱联用技术应用于中药单味药研究，对于全面、客观地阐明中药单味药的作用机制、质量评级等方面具有重要的意义。徐婷婷等[6]采用气相色谱-质谱联用技术检测了大鼠给予商陆后尿液中代谢产物的变化，发现肾损伤机制可能是通过影响三羧酸循环、氨基酸代谢等通路，进而引起氧化应激反应及细胞凋亡的发生。ZHANG Y等[7]利用GC-MS技术表明了金针菇多糖通过降低天冬氨酸转氨酶与丙氨酸转氨酶水平，增强抗氧化作用，减轻病理性损伤，对急性肝损伤起到肝保护作用。QI Y P等[8]采用气相色谱-质谱联用技术发现了急性炎症大鼠经白玉兰挥发油预处理后，十六烷酸、亚油酸、油酸、硬脂酸及胆固醇等代谢产物出现显著变化，而这正是白玉兰挥发油抗炎机制的合理解释。牟菲等[9]采用气相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术发现了冠心病心血瘀阻证大鼠血清标志物主要与糖代谢、脂代谢及氨基酸代谢通路相关，而苏合香可调节模型组大鼠体内紊乱的代谢通路。杜毅等[10]利用气相色谱-质谱联用仪发现了结晶肾损伤相关的生物标志物与嘌呤代谢物、氨基酸代谢物、脂肪酸等代谢物有关，表明金钱草提取物可通过调节失衡的代谢途径从而发挥预防及治疗结晶肾损伤的作用。张艳等[11]采用气相色谱-质谱联用技术发现了平菇多糖可通过调节肝损伤病大鼠尿液中的十六烷酸和1，2，3-丙烷酸水平，以及三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、抗坏血酸和醛酸、柠檬酸、苹果酸、D-葡萄糖醛酸等代谢通路改善肝损伤症状。常晋霞等[12]采用GC-MS代谢组学表明了刺五加总苷提取物具有降糖作用，其机制可能与调节能量代谢、氨基酸代谢、氨基酸生物合成及有机酸代谢相关。

中药复方发挥治疗对应证候的效果绝不是单味药物之间的简单加和，而是取决于质与量的关系，不同的质与量的组合发挥的治疗效果则不尽相同[13]。HUANG B X等[14]采用GC-MS代谢组学方法发现了高尿酸血症大鼠体内代谢产物的变化主要与甘油脂代谢、氨基酸代谢、原发性胆汁酸代谢、牛磺酸及次牛磺酸代谢、嘌呤代谢有关，推测二妙丸可能是通过将多种干扰途径恢复到正常状态来达到其抗高尿酸血症的作用。周倩等[15]采用气相色谱-质谱代谢组学技术表明了芪附汤可能是通过调节失衡的三羧酸循环、二羧酸代谢及花生四烯酸等代谢通路实现抗阿霉素心脏毒性的作用。赵小华等[16]采用气相色谱-质谱法测定了小青龙汤证大鼠血液中内源性代谢物。结果表明，小青龙汤证表现的能量代谢、免疫功能、炎症反应与乳酸、甘氨酸等标记物有关。JIANG Y等[17]采用气相色谱-质谱联用技术分析发现血必净治疗脓毒症的机制主要与能量代谢、葡萄糖代谢及氨基酸代谢的紊乱有关。李莎等[18]采用气相色谱-质谱方法表明了血必净注射液通过调节能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢及糖代谢发挥治疗百草枯中毒大鼠的作用。李莹等[19]基于GC-MS代谢组学方法发现了四逆汤中甘草涉及糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环及部分氨基酸等生物代谢途径，推测甘草可通过以上代谢途径减低附子的毒性。

1.2 GC-MS技术在民族药代谢组学研究中的应用

民族药是中国少数民族医药体系的重要组成部分，是少数民族人民用于预防、治疗及保健的天然药物。CHI A P[20]等采用气相色谱飞行时间质谱发现了藏药五味子多糖主要与TCA循环代谢途径，以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢途径有关，藏药五味子多糖对慢性疲劳综合征的治疗机制部分归因于这些紊乱途径的恢复。覃一枫等[21]采用 GC-MS 技术发现蒙药甘草总黄酮主要通过调节亚油酸及α-亚麻酸代谢起到减轻伊立替康胃肠道毒性作用。胡佳慧等[22]采用气相色谱与质谱联用的细胞代谢组学方法表明了姜黄素通过干扰肿瘤细胞的能量代谢、氨基酸代谢、微管体系、蛋白质合成及氧化应激反应等从而产生抗肿瘤机制。周亚敏等[23]采用GC-MS技术表明了蒙药玉竹多糖通过调节糖代谢、能量代谢、氨基酸代谢及脂类代谢等对甲亢阴虚发挥预防作用。谢辉辉等[24]采用气相色谱与质谱联用技术发现乌头碱及苯甲酰乌头原碱主要通过影响氨基酸代谢产生生殖毒性作用。

采用气相色谱-质谱联用技术对复方民族药进行药效物质基础及作用机制的研究已有报道。邝婷婷等[25]利用GC-MS代谢组学技术发现三果汤散对高原红细胞增多症具有干预作用。孙润彬等[26]采用GC-MS方法表明了昆布与蒙药甘草单煎与合煎提取物给药对三羧酸循环、脂肪酸β氧化、支链氨基酸以及糖代谢中间物均产生影响，合煎给药造成大鼠肾脏损伤较为明显，揭示了了蒙药甘草加重昆布的肾脏毒性作用。藏药黄芪具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌等功效。王守丽等[27]采用气相色谱-质谱发现黄芪汤中的主要成分芒柄花素及芒柄花素葡萄糖苷的水平在服药后均显著升高，而色氨酸、苯丙氨酸及胆酸等物质显著降低，表明这些代谢物与肝病及糖尿病的防治有关。

1.3 LC-MS技术在中药代谢组学研究中的应用

液相色谱-质谱联用技术是目前中药代谢组学应用最广泛的分离技术，利用液相色谱的高分离效能与质谱的强鉴定能力研究中药单味药，可为中药合理用药提供科学依据。马致洁等[28]采用液相色谱-质谱方法发现了何首乌造成肝损伤的动态机制及肝脏自我修复表现。WANG X Y等[29]采用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱代谢组学方法揭示出白豆蔻主要通过调节磷脂代谢途径对庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠起到保护作用。于栋华等[30]运用UPLC-Q-TOF-MS方法揭示了穿山龙提取物可能是通过促进半胱氨酸及甲硫氨酸代谢中胱硫醚向半胱氨酸的转化水平，上调色氨酸代谢中褪黑激素，从而实现对痛风性关节炎的防治作用。常晋霞等[31]采用UPLC-MS/MS识别方法发现了刺五加提取物发挥降糖作用可能与调节氨基酸、能量及脂代谢相关。赵一懿等[32]采用超高效液相色谱与三重四级杆飞行时间质谱联用技术为银杏叶提取物质量标准化研究提供了有力的实验依据。

液相色谱-质谱联用技术将研究对象作为一个整体进行研究，阐明中药复方药效物质基础及作用机制，是研究中药复方中复杂关系的最有效分析手段。YU X H等[33]采用液相色谱-质谱联用技术观察到养心汤干预组血清中潜在代谢标志物水平明显高于对照组，表明潜在的代谢标志物可用于诊断不稳定型心绞痛患者。彭琳秀等[34]采用基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS代谢组学技术发现复方祖师麻片主要通过下调溶血磷脂酰胆碱的水平从而达到治疗效果。李慧等[35]基于大鼠血浆的UPLCQ-TOF-MS代谢组学方法研究了正天丸治疗偏头痛的机制，研究结果表明，正天丸通过治疗偏头痛的代谢组学机制可能与磷脂酰胆碱、3，4-二羟苯乙二醇等化合物有关。GU Y Y等[36]基于UPLC-Q-TOF-MS代谢组学技术揭示了双黄连注射液可提高过敏反应大鼠血清组胺及类胰蛋白酶水平，主要与亚麻酸、苯丙氨酸、氨基酸、2-氧酸、嘌呤等代谢途径相关。LIU Y Y等[37]通过采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱发现甘草附子汤通过黄酮类、皂苷类、生物碱类的配伍可调节多种代谢途径的干扰达到治疗效果。马诗瑜等[38]基于UPLC-TOF-MS代谢组学技术发现大川芎方多组分中药制剂对急性偏头痛大鼠模型体内的差异代谢物有一定的回调作用，其作用机制主要与氨基酸代谢及犬尿氨酸的代谢有关。李泽华等[39]采用高效液相色谱联用四级杆飞行时间质谱技术表明了芍药甘草汤通过调节氨基酸、能量代谢失衡缓解过敏性哮喘。NIU X Y等[40]采用UHPLC-Q-TOF-MS分光光度法表明酸枣仁汤总多糖通过调节维生素、鞘脂、胆汁酸、磷脂及酰基肉碱等代谢途径从而抑制免疫缺陷刺激引起的失眠。闫广利等[41]利用UPLC-Q-TOF-MS技术发现茵陈蒿汤及其组分配伍均能显著减少肝脏细胞炎性浸润及肝纤维化。杨波等[42]采用UPLC-HDMS代谢组学方法发现了附子与甘草配伍后对其中10个毒性生物标记物具有明显的回调作用，表明附子与甘草配伍后可有效降低附子的毒性。刘职瑞等[43]采用LC-MS代谢组学方法发现了百合知母汤通过调节脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸代谢及脂质代谢等代谢通路发挥抗抑郁作用。

1.4 LC-MS技术在民族药代谢组学中的应用

近年来，液相色谱-质谱联用技术在民族药药物作用机制的代谢组学研究方面得到广泛应用。藏药三七具有化瘀止血，活血定痛的功效。申文雯等[44]采用UPLC-Q-TOF-MS技术阐明了蒸三七主要活性皂苷类组分在体内发挥药效与脱糖、硫酸化、脱羟甲基化、葡萄糖醛酸化、支链丢失等代谢途径有关。张晶等[45]采用超高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术分析了注射苗药铁筷子中3个香豆素化合物在大鼠体内的代谢变化，发现所涉及的代谢反应为葡萄糖醛酸化、磺酸化、还原等。艾小鹏等[46]采用LC-MS代谢组学技术方法揭示了藏药小檗皮对 STZ 诱导糖尿病肾病大鼠的保护机制可能与上调糖尿病肾病大鼠血清中的鸟氨酸含量，参与精氨酸与脯氨酸的代谢有关。郭娜等[47]采用超高效液相色谱联用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术表明了肉豆蔻-8散可有效调节氨基酸代谢与脂肪酸代谢失衡，对心肌缺血再灌注损伤起到预保护作用。李树颖等[48]采用LC-MS代谢组学方法发现了藏药黄芪多糖对小鼠活性的影响，发现其作用机制主要与氨基酸代谢、能量代谢及抗氧化作用等有关。红禾麻为贵州苗族民间用药，具有祛风除湿、活血化瘀、利尿等功效。时庆欣等[49]使用UPLC-QTOF-MS/MS技术发现了红禾麻降低血脂作用主要涉及体内脂质、糖类、维生素、氨基酸类成分的调控。杨改青等[50]采用液相色谱-质谱联用仪揭示了杜仲叶饲料影响绵羊的营养代谢、生理状态及免疫反应的作用机制主要涉及体内葡萄糖、脂肪酸及氨基酸等的代谢。此外，还与动物的免疫机能相关。蔡志伟等[51]采用UPLC-Q-TOF-MS探讨了藏药大黄配伍厚朴治疗大鼠急性胰腺炎病症的作用机制。结果表明，疗效最佳组与模型组区别的23种潜在标记物中下调3种、上调20种，为大黄厚朴组分配伍对急性胰腺炎疗效机制研究提供了重要线索。韩红祥等[52]等采用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱联用技术阐明了藏药五味子发挥治疗糖尿病并发症的作用与能量代谢、氨基酸代谢、肠内菌代谢、脂类代谢等有关。胡尧等[53]利用液相色谱-质谱联用技术发现了藏药红景天消除运动疲劳的作用机制可能与保护细胞膜、调节1，25-(OH)2D3→磷酸肌醇、甘油二酯通路，以及缓解运动后肌肉紧张度有关。迪丽索耶尔·亚勒坤木等[54]采用UPLC-Q-TOF-MS代谢组学方法发现了灵芝多糖可能通过调节牛磺酸及亚牛磺酸、甘油磷脂、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸等代谢途径来发挥辐射防护作用。

不同的单味药组合成民族药复方的治疗作用远大于单味药的单一疗效，仅使用单味药往往难以达到更好的治疗效果。李杰等[55]采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术，探讨了参麦方中蒙药人参与麦冬配伍的物质基础及作用机制；结果表明，参麦方是通过调节嘌呤、部分氨基酸、脂肪及能量代谢等代谢途径发挥保护心肌损伤作用。刘丹丹等[56]采用高效液相与质谱联用的方法研究了蒙药诃子对于生草乌的减毒存效作用机制。结果表明，生草乌可使大鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌红蛋白及肌钙蛋白的含量明显升高，蒙药诃子可降低谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌红蛋白及肌钙蛋白的含量，表明诃子对生草乌具有减毒作用。王静等[57]基于 UHPLC-Q-TOF-MS 分析技术发现了藏药多血康胶囊通过纠正能量代谢、氧化应激代谢、脂质代谢、肠道菌群等代谢通路来治疗高原红细胞增多症。藏药麻黄经常被用于治疗风湿痹痛及阴疽、咳痰等病症。孙启慧等[58]采用LC-TOF-MS方法发现了麻黄细辛附子汤可通过调节能量代谢途径，使其他甘油磷脂类物质趋于正常水平，表明了麻黄细辛附子汤对于肾阳虚外感病证具有良好的治疗作用。维吾尔族药红花为具有活血化瘀、散湿去肿的功效。董娟妮[59]利用高效液相-质谱代谢组学技术发现了红花-甘草药对通过调节寒凝血瘀模型大鼠体内的组氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、嘌呤、嘧啶及核黄素代谢通路及柠檬酸循环改善寒凝血瘀证。

2 色谱-质谱联用技术的应用展望

色谱-质谱联用技术是中药及民族药的药效物质基础、指纹图谱、谱效关系、配伍规律等现代化研究的重要技术平台。目前，中药及民族药的代谢组学研究面临新的挑战，即需要更多、更全面的物质代谢数据信息，以便形成药物作用机制更加完整的证据链。随着质谱仪检测灵敏度的提高，显现中药及民族药物更多微量成分的代谢信息终将变为现实。一些复杂生物样品处理方法的改进，如“液-液微萃取”技术有效解决了中药及民族药生物样品前处理时挥发性成分易损失的问题，进而扩大了气相色谱-质谱的应用范围。此外，整合代谢组学数据与基因组学、蛋白质组学及临床代谢数据，建立完善的数据库，才能更好阐释中药及民族药药效物质基础及整体作用机制。因此，色谱-质谱联用技术在中药及民族药物的蛋白质组学、代谢组学研究中前景广阔。