抗精神病药治疗对外周血单核细胞miRNA-92a-3p表达的影响

陆雅娜，王国强，张付全，殷嘉浚

精神分裂症是一组病因未明的重性精神病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，以阳性症状、阴性症状和认知缺陷为主要特征，影响患者感知觉、思维、情感和行为等多方面的功能[1-2]。该病不仅严重降低患者的生活质量，还会给社会带来负面的影响。抗精神病药是精神分裂症首选的治疗措施。有研究[3]表明，大脑中mRNA和蛋白质的异常水平可能与精神分裂症病因有关。micro RNA(miRNA)是长度为21～23 NT的单链RNA分子[4]；通过降解mRNA或者直接阻断翻译过程，达到阻止蛋白质的表达，从而对细胞通路产生重大影响[5-8]。近期研究[9]发现miRNA-92a-3p在精神分裂症的病因和病理生理学中起着重要作用。经本中心伦理委员会批准，本研究观察抗精神病药治疗对精神分裂症患者外周血单核细胞miRNA-92a-3p表达的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 患者组：为2017年4月至11月本中心门诊和住院治疗的精神分裂症患者26例。入组标准：①符合美国《精神障碍与统计手册》第5版(DSM-5) 精神分裂症诊断标准；②汉族，年龄18～60岁；③首发或者复发患者，入组前应未曾服药或已停药≥4周，阳性与阴性症状量表(PANSS)≥60分。④患者或监护人对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准：①精神活性物质滥用及其他重性精神疾病者； ②颅脑外伤及脑器质性疾病者； ③患精神分裂症以外的遗传疾病者；④3个月内曾行无抽搐电休克治疗(MECT) 者；⑤孕期或哺乳期患者。其中男12例，女l4例；平均年龄 (36.0±10.1)岁。对照组：为同期招募的社会志愿者48名；18～60岁；与入组患者无血缘关系； 两系三代内无精神疾病家族史，无严重神经系统疾病或其他严重躯体疾病者、严重脑外伤史者；近1个月内无输血史。受试者自愿参加，并签署知情同意书。其中男17名，女31名；平均年龄(31.6±6.9)岁。组间性别、年龄比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法及量表评定 患者入组后即给予非典型抗精神病药单药治疗，其中奥氮平6例，利培酮15例，氯氮平2例，喹硫平1例，齐拉西酮1例，阿立哌唑1例。在2～4 周里逐渐增加到有效剂量，疗程12周。治疗前后给予PANSS评定临床症状。

1.2.2 外周血单核细胞miRNA-92a-3p检测 利用RT-qPCR法检测患者组治疗前后及对照组外周血单核细胞miRNA-92a-3p表达水平。使用BD静脉真空采血管采集受试者静脉全血2.5 ml，颠倒混匀，每50～100 mg组织样品，加入1 ml TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆。收获细胞 1～5×107，移入 1.5 ml离心管中，加入 1 ml TRIZOL，混匀，室温静置 5 min。离心后将所分离的单核细胞置于冻存管中-80℃保存备用。逆转录RNA与实时荧光定量PCR：采用TRIZOL(Invitrogen公司；美国)试剂盒从外周血单核细胞(PBMC)中分离总RNA，使用cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司；美国)将高容量的RNA逆转录合成cDNA，使用补充数据表SXX和SYBRSelectMasterMix(Invitrogen；USA)中列出的引物进行RT-qPCR。 使用7900HT实时PCR仪(Applied Biosystems；USA)对于3个独立样品中的每一个，RT-qPCR一式三份进行。选择内参(小核RNA U6)分别进行Realtime PCR反应。内参U6双向引物序列(5'-3')GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT(6-Forward)，CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(6-Reverse)；has-miR-92a-3p(5'-3')GGGTATTGCACTTGTCCCG (6-Forward)，GTGCGTGTCGTGGAGTCG(6-Reverse)。退火温度均为60℃。 数据采用2- △△ CT法进行分析。

1.2.3 统计学方法 数据结果采用Data Assist 3.0和SPSS 20.0软件进行统计分析。以小核RNA U6为内参，以对照组1号样本为基准，以所测miRNA与内参小核RNA U6的阈值环(Ct)之差再与基准(对照组1号)miRNA与内参U6之差的差值计算为△△Ct值，以2-△△Ct表示miRNA相对表达水平。采用Mann-Whitney U 检验比较对照组与研究组用药前miRNA表达水平的差异。采用Wilcoxon秩和检验比较研究组用药前与用药12周末miRNA表达水平的差异。Spearman相关分析miRNA表达与PANSS评分的相关性。

2 结果

2.1 两组miR-92a-3p相对表达量比较 外周血单核细胞miR-92a-3p相对表达量患者组治疗前后分别为(6.697±3.870)及(11.119±8.390)，明显高于对照组(1.428±0.838)(P均<0.01)；患者组治疗后表达较治疗前明显上调(Z=-2.172，P<0.05)。

2.2 外周血单核细胞miR-92a-3p表达与PANSS总分相关性分析 患者组外周血单核细胞miR-92a-3p表达水平变化与PANSS总分变化无显著相关性(P>0.05)。

3 讨论

Sempere等[10]发现精神分裂症患者颞上回中micorRNA(miRNA)表达的升高对疾病具有广泛的意义，而每一个miRNA分子能够影响数百个靶基因的表达。在线独立软件程序(TargetScan和miRanda)预测了6000个靶基因,GO数据库分析后表明突触后致密物(PSD)与精神分裂症相关。研究[11]表明,PSD蛋白被认为是治疗精神分裂症的潜在分子靶点。且miRNA靶向基因网络确定了PSD3作为miR-92a-3p的靶基因[12]。基于此，可将miR-92a-3p用作精神分裂症疾病的生物标志物，与本研究中患者组miRNA-92a-3p的表达水平与对照组相比，差异有统计学意义的结果是一致的。

有研究发现抗精神病药能改变miRNA 的潜在网络，这些网络与BDNF、谷氨酸和5-HT等密切相关[13]。数据库miRPathDB预测miR-92a-3p的另一靶基因为肿瘤抑制因子PTEN，即磷酸酶和张力蛋白同源物，可通过PI3K / AKT / GSK3途径，调节神经元细胞增殖，迁移和凋亡[14-21]，参与精神分裂症的病理生理过程[22-23]。其中GSK3已被证实作为几种非典型抗精神病药的共同靶点[24-26]。本研究发现精神分裂症患者组miR-92a-3p表达上调，经药物治疗后表达仍显著上调，由此推测精神分裂症患者外周血单核细胞中miR-92a-3p存在异常表达，且在抗精神病药物治疗12周后，miR-92a-3p通过靶基因调控，阻断蛋白分子的表达，参与神经元通路，影响其信号转导，与谷氨酸等通路相互作用，表达量发生变化。本研究结果同时显示，患者组治疗前后miRNA-92a-3p相对表达量变化与PANSS总分变化无相关性。提示miR-92a-3p的差异表达与疾病严重程度无明显相关性。关于miR-92a-3p与精神分裂症发病机制的研究不多，上述结果表明，miRNA-92a-3p可作为精神分裂症疾病的生物标志物，抗精神病药对精神分裂症的治疗可能通过上调miR-92a-3p实现，但对预测疾病转归及预后有待进一步明确。本研究的局限是样本量有限，在今后的研究中可以扩大样本量进行研究。