模式识别受体与HPV感染及宫颈癌的相关研究进展

万晓琪，蔡园杰，王艳

(哈尔滨医科大学附属第一医院妇科，哈尔滨 150001)

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中居第2位，严重威胁着女性健康[1]。高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续性感染是宫颈癌的主要危险因素，大部分患者感染HPV后，免疫系统可清除病毒，只有10%～15%的患者不能有效清除，成为HPV持续感染者，约1%的高危型HPV感染者最终发展为宫颈癌[2-3]。高危型HPV(主要为16/18)与宫颈癌关系密切，持续的病毒感染可能与高危型HPV逃避免疫清除的能力有关[4]。先天性免疫是大部分哺乳动物保护机体的第一道防线，宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原体上的分子特征，如单链RNA、双链RNA、CpG未甲基化DNA等，这些保存在大多数微生物上的分子特征被称为病原体相关分子模式，PRR在识别病毒病原体相关分子模式后，促发级联信号，引起促炎细胞因子、趋化因子以及Ⅰ型干扰素释放，发挥抵御病原体的作用[5-6]。目前研究表明，PRR对于清除宫颈HPV感染至关重要，而PRR在不同机制调节下异常表达，参与宫颈癌的发生，此外，通过调节PPR可诱导宫颈癌细胞凋亡，这为宫颈癌的预防和治疗提供了一个新思路[7-12]。现就不同PRR在宫颈HPV感染及宫颈癌中的相关作用进行综述。

1 PRR概述

PRR存在于细胞内外，通过识别病原体相关分子模式启动天然免疫，主要包括五大类：Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)家族、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor，NLR)家族、视黄酸诱导基因Ⅰ样受体(retinoic acid-inducible gene Ⅰ-like receptor，RLR)家族、C型凝集素受体家族和DNA感受器[13-14]。关于TLR和RLR与宫颈癌的相关报道较多，下面主要介绍这两个家族的结构和通路。

1.1TLR TLR是最早发现和研究的一类PRR，是定位于细胞质膜或内体膜上的一种跨膜蛋白，主要识别细菌外膜组成部分和病原微生物核酸。TLR属于Ⅰ型穿膜蛋白，有富含亮氨酸的N端胞外区、富含半胱氨酸的穿膜区和Toll/白细胞介素(interleukin,IL)-1R(TIR)同源的C端胞内区[15]，其中TIR结构域是与下游配体结合传导信号的主要结构域。TLR包含多个家族成员，广泛表达于免疫细胞(树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等)及非免疫细胞(上皮细胞、成纤维细胞)。目前已发现10种功能性TLR，其中TLR1、2、4、5、6、10主要存在于细胞膜表面，TLR3、7、8、9主要存在于细胞内体膜[16]。TLR可识别不同的分子结构，包括病毒和细菌中的dsRNA(TLR3)、脂多糖(TLR4)、鞭毛蛋白(TLR5)、ssRNA(TLR7、TLR8)及CpG未甲基化DNA(TLR9)[17]。TLR存在髓样分化因子88依赖型以及干扰素TIR结构域衔接蛋白(又称为髓样分化因子88非依赖型)两种信号转导通路，通过这两条通路激活信号级联转导，调控核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶、炎症因子和Ⅰ型干扰素的表达[18]。

1.2RLR RLR为一类胞质内PRR，主要识别双链RNA，包括视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA-5)及遗传生理实验室蛋白2[19]。RLR均具有中央解旋酶结构域和C端结构域，其中RIG-Ⅰ与MDA-5 N端还有两个胱天蛋白酶激活和募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)，可与下游线粒体膜上的接头分子结合，传递信号，遗传生理实验室蛋白2不具有CARD，有学者认为其具有调控RIG-Ⅰ 及MDA-5的作用[20]。RIG-Ⅰ主要识别短dsRNA和5′-ppp-RNA，越来越多的证据表明一些DNA病毒也能被RIG-Ⅰ 识别，MDA-5主要识别长dsRNA，当RLR中央解旋酶区与RNA结合后，激活自身CARD，在其他调节因子的作用下，RLR寡聚化，通过与线粒体抗病毒信号蛋白接头分子结合，激活下游级联信号(肿瘤坏死因子受体相关因子、TANK结合激酶1)，最终导致干扰素反应因子(interferon response factor，IRF)3或IRF7激活，诱导Ⅰ型干扰素及干扰素刺激基因的表达[21-22]。

虽然不同的PRR家族结构和配体不同，但它们的下游信号通路及酶有部分重合，最终导致NF-κB和IRF3/7的激活，NF-κB促进促炎症因子及趋化因子的转录激活，而IRF3/7诱发Ⅰ型干扰素的产生，干扰素还可通过旁分泌或自分泌调节因子，诱导大量干扰素刺激基因的转录，抑制病毒复制，同时还能诱导细胞凋亡[23]。

2 TLR与HPV感染及宫颈癌

2.1TLR与HPV感染 TLR作为最早发现的免疫系统识别病原体的受体之一，在宿主对宫颈HPV感染启动先天免疫反应过程中起重要作用。机体可通过调控TLR的表达，启动对HPV感染的免疫应答，Daud等[7]研究发现，除TLR4外的所有TLR及α2干扰素在宫颈HPV16感染自行转阴的病例中均显著增加，表明TLR及其介导的信号通路对清除HPV至关重要。同样，在宫颈癌前病变中，与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅱ持续/进展患者相比，TLR2和TLR7在CINⅡ转阴病例中表达增加，证明宫颈黏膜中高水平的TLR2、TLR7对CINⅡ的消除起重要作用[8]。在HPV感染过程中，TLR升高可以清除病毒，而TLR降低可引起HPV免疫逃避导致其持续性感染，p16INK4A是高危型HPV整合到宿主细胞的标志物，在HPV持续感染中表达增加。Yu等[24]报道，TLR4的表达随着宫颈病变病理分级的升高而降低，与p16INK4A呈负相关，故HPV可能下调TLR4表达，利于其持续性感染。与之类似，研究发现TLR4及其下游信号分子IRF7和JUN(Jun oncogene)在HPV阳性的正常宫颈组织中表达显著增加，而在宫颈癌组织中表达显著降低，提示在感染早期机体可能通过上调TLR表达清除病毒，而在持续感染过程中TLR及其介导的免疫通路被抑制，使HPV不能被有效清除，从而引起宫颈病变甚至宫颈癌的发生[25]。

2.2TLR与宫颈癌 在HPV感染过程中，TLR激活的不同结果取决于机体对TLR表达的调控及HPV对TLR表达抑制之间的平衡，TLR升高可以清除HPV，然而，TLR的持续升高若不能有效清除HPV则会导致慢性炎症的产生，促使宫颈癌的发生[9]。Cannella等[26]研究发现，TLR9在持续感染同一HPV基因型的患者中过度激活，TLR9水平升高可能介导持续性的炎症反应，增加宫颈病变风险。此外，Ghosh等[27]报道，与正常组织相比，TLR2和TLR9在CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级以及宫颈鳞状细胞癌组织中的表达逐渐升高，并认为TLR2和TLR9可作为早期检测疾病的指标。上述结果表明，TLR可能与HPV感染协同参与宫颈癌的发生过程。

除TLR的自身高表达外，TLR也与慢性炎症相关分子表达相关，其表达升高可以改变宫颈局部微环境，诱导肿瘤的发生。在宫颈癌中，肿瘤坏死因子通过增加细胞周期蛋白依赖性激酶活性和HPV16 E6/E7 RNA表达，促进细胞周期进展，并且肿瘤坏死因子还能增强表皮生长因子受体的转录和稳定性，促进细胞增殖及肿瘤发展。de Matos等[9]研究发现TLR2、TLR4在宫颈鳞状细胞癌组织中高表达，并与肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β的表达升高具有相关性，故TLR可能介导慢性炎症促肿瘤微环境过程，促进肿瘤发生。此外，一氧化氮也是慢性炎症致肿瘤微环境形成的关键成分之一，可促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移。在诱导型一氧化氮合酶作用下一氧化氮大量合成，该酶在多种恶性肿瘤中高表达[28-29]。Li等[30]研究发现，TLR3、4、7、8在宫颈癌组织中表达升高，进一步观察发现TLR4、诱导型一氧化氮合酶在HPV阳性的宫颈癌细胞中表达明显升高，故TLR4/一氧化氮信号通路的激活可能参与高危型HPV感染所致宫颈癌的发病机制。

TLR可能与宫颈癌抗细胞凋亡相关，Cheng等[10]研究发现，TLR4在宫颈癌组织中高表达，其可激活NF-κB介导的IL-6及转化生长因子-β的分泌。转化生长因子-β及IL-6可以抑制树突状细胞的激活，抑制免疫应答，故TLR4高表达可增强宫颈癌细胞的抗凋亡能力，促进宫颈癌细胞增殖。此外，研究发现TLR7、TLR8在宫颈癌组织中也高表达，并且在宫颈癌细胞中激活TLR8可显著增加Bcl-2、血管内皮生长因子的表达[31]。Bcl-2蛋白家族可通过抑制细胞凋亡信号促进肿瘤发生，而血管内皮生长因子是肿瘤血管生成中最有效的血管生成因子，与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的不良预后密切相关，表明TLR8可通过抑制细胞凋亡及促进肿瘤血管生成参与宫颈癌的发生。TLR信号通路的过度激活可与多种信号通路发生交联，集成炎症反应，并可协助肿瘤细胞逃避免疫应答，在肿瘤发生中扮演重要角色。

以上证据表明，TLR对清除宫颈HPV感染起重要作用，然而，在肿瘤细胞及肿瘤微环境中，TLR还可以通过转导促炎症反应、抗细胞凋亡、促进细胞增殖促进肿瘤发展。

3 RLR与HPV感染及宫颈癌

3.1RLR与HPV感染 目前RIG-Ⅰ识别HPV的证据尚不充分，但有证据表明[32-33]HPV可通过不同的机制使RIG-Ⅰ介导的信号通路失活。SUV39H1是组蛋白3的赖氨酸9的三甲基化酶，是一种染色质抑制因子，Lo Cigno等[32]研究发现，HPV的E7病毒蛋白可以激活SUV39H1的转录，从而抑制RIG-Ⅰ、循环GMP-AMP合成酶和干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene，STING)基因转录，逃避先天免疫应答，为其持续性感染创造条件。在病毒感染过程中，RIG-Ⅰ发挥免疫应答作用需要与其上游的关键激活因子E3泛素连接酶三基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25，TRIM25)相结合，TRIM25通过与RIG-Ⅰ 的CARD结合介导泛素化促进RIG-Ⅰ 寡聚，引起Ⅰ型干扰素产生及干扰素刺激基因表达，而泛素特异性蛋白酶15通过与TRIM25结合，保护其不被蛋白酶所降解，增强TRIM25稳定性并最终增强RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型干扰素反应。Chiang等[33]报道，HPV的E6病毒蛋白可与泛素特异性蛋白酶15结合，阻止其与TRIM25相互作用而导致TRIM25降解，从而抑制RIG-Ⅰ介导的先天免疫信号，这是HPV抑制RIG-Ⅰ介导的抗病毒反应的又一分子机制。上述研究表明，HPV持续性感染过程中可以通过不同的机制抑制RIG-Ⅰ信号通路的激活，从而逃避先天免疫反应，介导宫颈癌细胞恶性转化的发生。

3.2RLR与宫颈癌 RIG-Ⅰ可以促肿瘤细胞凋亡，Wang等[11]观察发现，RIG-Ⅰ可以抑制宫颈癌细胞的生长，与空白对照组相比，转染RIG-Ⅰ后48、72、96 h宫颈癌细胞的存活率分别降低22%、18%和11%，而沉默RIG-Ⅰ后48、72、96 h宫颈癌细胞的存活率增加1.4倍、1.3倍和1.2倍。虽然RIG-Ⅰ可以抑制宫颈癌细胞增殖，但RLR在宫颈病变、宫颈癌组织中表达以及与病理分级关系的报道较少，在其他肿瘤组织发现，胃癌[34]及肝癌[35]组织中RIG-Ⅰ表达降低，其低表达与患者的不良预后相关，与之相反，RIG-Ⅰ在癌性卵巢中高表达，提示RIG-Ⅰ基因异常表达参与卵巢组织恶性转化过程，并且其表达可能与卵巢癌进展和复发相关[36]。可见，RIG-Ⅰ在不同的肿瘤中表达水平不同，在宫颈癌中虽然RIG-Ⅰ可以抑制细胞增殖，但其在宫颈癌中的表达水平及与病理分级的关系是否可以作为宫颈癌患者的预后检测因子有待进一步研究。

4 NLR与HPV感染及宫颈癌

NLR为一类胞质PPR，其特征结构包括中央核苷酸结合和寡聚结构域、C端富含亮氨酸的重复序列和N端CARD或pyrin结构域，其中CARD结构域主要连接NLR受体分子与下游的衔接蛋白及效应分子[37]。根据N端结构域的不同NLR分为4个亚型：NLRA受体家族(Ⅱ类主要组织相容性复合物反式激活因子)、NLRB(神经元凋亡抑制剂蛋白)、NLRC[包括核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(nucleotide oligomerization domain,NOD)1、NOD2、NLRC3等]和NLRP家族(NLPR1-14)[38]。NOD1及NOD2是NLR家族中最典型的成员，它们不仅通过信号转导激活下游NF-κB及促分裂原活化的蛋白激酶信号通路，介导IL-1β等促炎细胞因子的产生，还可以促进Ⅰ型干扰素的产生，发挥免疫应答作用[39]。

NOD1在多种肿瘤中表现出抑癌特性[40]。在宫颈癌中，Liu等[41]发现NOD1在正常宫颈组织、CIN、宫颈鳞状细胞癌中的表达逐渐降低，与p16INK4A呈负相关，并在体外实验中发现NOD1可增强宫颈癌细胞对凋亡诱导剂的敏感性。NOD1介导病毒感染过程中的炎症及清除，还通过与下游因子受体相互作用蛋白2 CARD的相互作用参与凋亡信号通路的激活，在HPV感染过程中NOD1表达水平下调，导致炎症失调及细胞凋亡减少，促进肿瘤的发展[42]。然而，关于NLR中其他成员与宫颈病变及宫颈癌组织的报道仍较缺乏，它们与宫颈病变的关系需要更多研究的证实。

5 DNA感受器与HPV感染及宫颈癌

目前已经发现多种识别dsDNA的胞内受体，被称为DNA感受器。DNA感受器根据其传递信号的不同通路分为STING依赖型及STING非依赖型两类。PYHIN(the pyrin and HIN domain family)蛋白家族成员之一γ干扰素诱导蛋白16为STING依赖型DNA感受器的一员，AIM2样受体家族成员黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)属于非STING依赖型DNA感受器[38]。STING依赖型DNA感受器通过与STING结合，最终激活IRF3/IRF7或NF-κB，诱导Ⅰ型干扰素及炎症因子的产生[43]。

γ干扰素诱导蛋白16可以激活病毒防御的STING-TBK1信号通路，在肝细胞癌中激活p53信号通路和炎症小体发生抑癌作用[44]。但在宫颈癌中，Cai等[45]发现，与HPV-宫颈癌组织相比，γ干扰素诱导蛋白16和程序性细胞死亡配体1在HPV阳性宫颈癌细胞及组织中高表达，且γ干扰素诱导蛋白16通过STING-TBK1-NF-κB途径调控程序性细胞死亡配体1的表达，具有协同致癌作用。程序性细胞死亡配体1是一种存在于肿瘤细胞在内的多种细胞表面的生物标志物，可以帮助肿瘤细胞逃脱免疫细胞的攻击，其与γ干扰素诱导蛋白16在体内外实验中均表现出促宫颈肿瘤生长作用，可能通过参与HPV逃避免疫应答的调节机制促进宫颈癌进展。

此外，AIM2通过与凋亡相关斑点样蛋白结合，激活胱天蛋白酶1，促进IL-1β、IL-8的产生，介导免疫细胞在感染和组织损伤部位激活，诱导一种快速的、促炎性细胞死亡，即“细胞焦亡”[46]。So等[47]发现，AIM2在HPV感染的宫颈癌细胞中表达降低，其基因的转录受沉默信息调节因子1的负向调控，沉默信息调节因子1后可恢复AIM2表达促进癌细胞死亡。沉默信息调节因子1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的蛋白去乙酰化酶，可通过去乙酰化和灭活NF-κB的p65/RelA亚基抑制免疫反应，沉默信息调节因子1在宫颈癌细胞中过表达，并且与宫颈癌的临床不良预后相关，AMI2在沉默信息调节因子1作用下表达降低，使AIM2诱导炎症反应引起的细胞生长抑制减少，HPV逃避免疫应答，促进了宫颈癌的发展。

上述研究表明，HPV可通过不同的分子机制逃避免疫应答，不同的PPR(如TLR、RLR、NLR)及部分 DNA感受器所介导的免疫反应可被HPV干扰，利于HPV持续性感染。此外，PPR还可以通过介导慢性炎症反应，创造肿瘤微环境，促进宫颈癌的发生发展。

6 PRR与宫颈癌的治疗

PRR在先天免疫过程中起重要作用，将PRR激动剂作为佐剂结合预防性和治疗性疫苗，在宫颈癌的预防和治疗中具有重要意义。佐剂可提高疫苗的免疫原性，促进T细胞抵抗病毒感染，目前已有多种PRR激动剂作为佐剂用于预防性和治疗性HPV疫苗的报道[12]，包括CpG ODNs(未甲基化CpG二核苷酸)(TLR9激动剂)、鞭毛蛋白(TLR5激动剂)、咪唑莫特(TLR7激动剂)、艾西喹莫特(TLR7/8激动剂)，TLR结合配体可以促进树突状细胞的分化和成熟，刺激抗原呈递细胞表面分子的表达，促进细胞因子的产生[3]。Chang等[48]报道，具有TLR2激动剂活性的重组脂蛋白联合CpG ODNs可以增加宫颈癌小鼠模型的抗肿瘤免疫，减少肿瘤相关免疫抑制细胞的数量，CpG ODNs与重组脂蛋白的结合为开发肿瘤疫苗提供了一种可行的方法。此外，Poly(I∶C)(一种dsRNA的免疫刺激物和合成模拟物)是TLR3、RIG-Ⅰ、MDA-5的激动剂，已被报道在胃癌[49]、卵巢癌[50]、前列腺癌[51]、胰腺癌[52]中促进肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤效应。近年有文献报道，Poly(I∶C)在宫颈癌细胞中也能促细胞凋亡[53]，这与其促进宫颈癌细胞中促炎肿瘤微环境的形成有关。PPR激动剂可以作为佐剂增强预防性及治疗性HPV疫苗的作用，并且在肿瘤细胞中可引起细胞凋亡，在宫颈癌的治疗中是一个研究热点。

7 小 结

PRR可启动先天免疫应答抵御病原体，高危型HPV的持续性感染是宫颈的主要危险因素，大量证据支持TLR在清除HPV感染过程中发挥重要作用，而关于RLR、NLR、C型凝集素受体家族及DNA感受器的报道较少，未来PRR在宫颈HPV感染中的作用有待进一步研究。此外，PRR的表达也可促进宫颈癌的发展，可能与慢性炎症及肿瘤微环境相关，并且HPV可通过不同的机制逃避先天免疫应答，促进宫颈癌的发生发展。病毒和免疫因子之间的平衡为HPV相关宫颈癌的疫苗防御和治疗提供了关键信息，PRR激动剂作为分子佐剂为预防HPV感染和治疗宫颈癌提供了新思路，期待未来有更多的临床证据，为宫颈癌的治疗提供新方法。