肖逸雯,申秦颢,尹康
(昆明医科大学附属口腔医院a.正畸科,b.牙周科,昆明 650106)
地球表面存在20~65 μT的弱磁场。磁场根据强度分为弱磁场(<1 mT)、中磁场(1 mT~1 T)、强磁场(1~5 T)和超强磁场(>5 T);根据频率又可分成静磁场(static magnetic field,SMF)和动磁场,动磁场分成脉动磁场、脉冲磁场和交变磁场,其中脉冲电磁场(pulsed electromagnetic field,PEMF)是由带电物体产生的一种物理磁场,SMF磁感应强度和方向不随时间变化。随着科学技术的发展,磁被广泛应用于生产和生活的各个方面,生物个体暴露于不同强度磁场的机会增加,因此磁场对生物个体的影响受到广泛关注。2 000年前,古代中医用磁石治疗风湿、水肿和头痛。自1979年电磁场被美国食品药品管理局批准用于治疗骨病以来,磁研究涉及心血管、内分泌和骨骼系统等领域,磁场单独或与其他物理化学物质结合使用可明显减轻部分疼痛,改善疾病症状[1]。自Bassett等[2]首次报道电磁场可加速骨折愈合以来,有研究表明PEMF和SMF治疗多种骨病效果满意,如促进骨折愈合、骨形成、加速骨生长以及抑制骨丢失[3-5],并可刺激软骨细胞增殖,增加基质合成,可用于关节炎的治疗[6-7]。以上研究提示,PEMF和SMF可作为维持和治疗软骨和骨疾病的潜在物理疗法。现就磁场对软骨和骨组织影响的研究进展予以综述。
1.1磁场对软骨细胞的影响 软骨由软骨细胞和胞外基质组成,其中软骨细胞合成并分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。蛋白聚糖带负电荷并具有吸水性,能维持软骨的弹性和关节面润滑。研究发现,磁场可影响软骨细胞的生成[8-9],PEMF通过开放电压敏感钙通道以刺激DNA合成,促进人软骨细胞增殖以及细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成[10],并抑制软骨细胞凋亡[11]。PEMF可能通过以下途径发挥作用:①电动势可改变钙离子在细胞膜上的通量,导致胞质钙离子水平升高,一氧化氮合成增加,从而激活一氧化氮-环鸟苷酸-蛋白激酶G通路,促进软骨细胞增殖[9];②抑制促分裂原活化的蛋白激酶发挥作用[12];③上调X连锁凋亡抑制蛋白以及下调Bax的表达,从而抑制软骨细胞凋亡[13]。但有研究发现,经PEMF处理后软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺聚糖的合成无显著变化[14],这可能与磁场的强度、暴露时间、细胞来源、治疗组合等有关;而细胞增殖效应与血清浓度、细胞密度和生长阶段等有关。
1.2磁场可作为腺苷受体A2A和A3的激动剂 腺苷是一种遍布于人体细胞的内源性核苷,其与4种细胞表面腺苷受体亚型(A1、A2A、A2B和A3)结合,这些亚型与不同的G蛋白偶联,从而抑制单核巨噬细胞释放炎症因子,其中腺苷受体A2A的抗炎活性最高。腺苷水平在软骨中受到严格调控,腺苷受体激动剂具有保护关节软骨的作用[15]。Ongaro等[16]发现,磁场对细胞膜上的腺苷受体A2A和A3有直接作用,PEMF可上调人软骨细胞中腺苷受体A2A和A3的表达,抑制促炎因子表达,而促炎因子[前列腺素E2、白细胞介素(interleukin,IL)-6、8和IL-10等]的分解代谢作用会引起软骨退化。另一项研究表明,软骨外植体暴露于PEMF后蛋白聚糖合成增加,当向培养基中加入IL-1β后,蛋白聚糖的合成显著减少;但当培养物暴露于PEMF后,蛋白聚糖合成又恢复至基础水平,表明PEMF可逆转IL-1β对软骨基质的分解代谢作用[17]。有学者发现,胰岛素生长因子-1与PEMF刺激具有协同增效作用,能促进全厚度软骨外植体的合成代谢活动,抵消促炎因子IL-1β的分解代谢作用[7]。以上研究表明,PEMF可作为腺苷受体A2A和A3的激动剂发挥抗炎作用。
1.3磁场对关节软骨的保护作用 关节软骨中无血管、神经以及淋巴组织,小幅度重复或长时间超负荷运动可致软骨损伤,局部软骨细胞迅速凋亡,随着关节内部结构的破坏,会引发骨关节炎(osteoarthritis,OA)。炎症细胞和促炎因子的激活可致细胞外基质降解,损伤软骨的机械性能。近年来,磁场作为一种非侵入性的治疗手段对OA有积极作用,不仅能促进软骨细胞的合成代谢,还能抑制分解代谢,刺激细胞因子[如转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β]表达以抑制炎症过程引起的软骨细胞和细胞外基质减少。Ciombor等[18]首次报道PEMF能延缓豚鼠OA发展。PEMF通过靶向TGF-β刺激细胞外基质蛋白聚糖表达,并直接抑制基质金属蛋白酶和IL-1β的活性,加速组织修复,维持关节软骨形态[18]。有学者利用前交叉韧带切除术建立兔OA模型发现,电磁场刺激下调了分解代谢因子(如血清肿瘤坏死因子-α和胱天蛋白酶3、8)的表达,从而抑制软骨细胞凋亡,防止软骨退化[19]。PEMF有渗透整个关节软骨及下方软骨下骨的能力。研究显示,PEMF通过作用于软骨和软骨下骨抑制OA进展,其显著降低了软骨组织学Mankin′s评分,减少软骨不规则表面的产生,提高了蛋白聚糖含量,增加了软骨厚度;增加软骨下骨骨小梁厚度和骨小梁间距,减少了骨小梁数目,从而避免OA软骨下骨骨硬化[20]。其机制可能与Wnt/β联蛋白和骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子信号通路激活有关,从而保护软骨下松质骨的微结构[21]。可见,PEMF具有用于OA辅助治疗的潜力,其可抑制软骨细胞凋亡和炎症细胞因子生成,同时提高软骨细胞和软骨下骨的合成代谢活性,促进基质合成,增强修复反应,最终防止软骨退化,阻止OA进展。
1.4磁场与软骨组织工程 干细胞具有独特的自我更新和分化为多种细胞的能力,在组织再生和维持动态平衡方面发挥重要作用。干细胞在体内受物理和化学因素刺激,如磁场、流体剪切力、营养因子以及底物应变等,根据所处微环境及刺激分化成所需组织。研究表明,PEMF能提高骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)的增殖率,且BMSC开始增殖时间更早,在指数生长期细胞密度可增加20%~60%[22]。磁场不仅刺激细胞增殖,也可影响细胞周期,磁场刺激后可使代表DNA合成期的S期细胞百分比增加[23]。此外,Ren等[24]观察到电磁场有促进人间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,软骨细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达增加,其可能通过上调TGF-β表达实现[25]。以上研究提示,磁场刺激BMSC向软骨细胞分化,为软骨组织工程的再生医学提供了新见解。
关节软骨因血供限制而缺乏再生能力,组织工程是实现软骨重建的重要策略。组织工程的三要素为信号、细胞和支架,其中信号因子骨形态发生蛋白和TGF促进关节软骨细胞和滑膜细胞分泌润滑脂[26],为组织工程再生低摩擦关节提供有益条件。磁场可通过上调骨形态发生蛋白2的表达,提高成骨效应[27]。Amin等[25]也报道,PEMF通过TGF-β途径促进软骨细胞分化。支架为MSCs的生长或软骨细胞附着、增殖、活化及胞外基质沉积提供了微环境,但病变炎症环境中的炎症细胞因子可使细胞向成纤维表型分化,并引起支架降解,故支架和细胞移植微环境非常重要。PEMF与组织工程结合能促进植入细胞和周围组织的合成代谢,保护细胞免受炎症分解影响,PEMF通过增强腺苷受体A2A和A3的表达,从而抑制核因子κB信号转导途径[28]。核因子κB不仅在软骨炎症应激反应中起核心作用,还调控软骨细胞外基质蛋白的积累重塑。此外,PEMF还可促进植入的支架与周围组织融合,如犬膝关节软骨缺损植入支架后,PEMF有助于骨整合、早期稳定移植物,防止移植后软骨下骨再吸收,对软骨再生有积极影响[29]。兔膝关节软骨缺损植入骨髓浓缩物和支架后,PEMF能明显增加软骨细胞密度、基质蛋白聚糖含量,并改善骨小梁结构,有助于软骨组织的再生[30]。综上可知,PEMF通过双重作用促进组织工程再生产:①刺激细胞增殖、支架定植以及组织基质产生;②手术植入支架后防止植入细胞和周围组织免受炎症分解代谢的影响。
2.1磁场对成骨细胞、BMSC和骨细胞的影响 骨主要由成骨细胞、BMSC、骨细胞和破骨细胞组成,是一种不断更新的组织。骨折修复和重建需成骨细胞参与。成骨细胞的分化分为三个阶段:增殖、基质成熟和矿化,可根据成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2以及矿化结节等确定分化程度。目前研究涉及的成骨细胞系有大鼠成骨肉瘤细胞ROS17/2.8、大鼠骨肉瘤细胞UMR 106和人骨肉瘤细胞MG63,磁场可促成骨细胞增殖,但存在一定争议。如暴露在SMF(160、280、340 mT)下2~10 d对大鼠成骨肉瘤细胞ROS17/2.8和大鼠骨肉瘤细胞UMR 106的增殖率无影响[31]。Huang等[32]将人骨肉瘤细胞MG63暴露于SMF(400 mT)1 d后发现,细胞广泛突起呈星形,并在表面形成多层结构。同时该研究还发现,SMF可促进人骨肉瘤细胞MG63增殖,但促增殖作用依赖于初始细胞密度,在特定初始密度下接种可促进细胞增殖[32]。其原因可能为当细胞增殖到一定程度时,会产生细胞间接触抑制。此外,SMF还可上调早期成骨细胞分化标志物骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2信使RNA的表达及基质合成,并促进成骨细胞矿化结节形成[33]。
PEMF能促进BMSC的定向迁移、成骨向分化过程中的细胞增殖,上调成骨相关基因和蛋白(如骨钙素、碱性磷酸酶和Runt相关转录因子2)的表达,并可上调BMSC成骨向分化过程早中期标志物碱性磷酸酶的活性,促进细胞外基质矿化[34]。BMSC是成骨细胞的来源,磁场有助于促进骨组织工程种子细胞向成骨向分化,为骨折的治疗提供新思路。
骨细胞镶嵌于矿化基质中,是成熟骨组织的主要细胞。Qian等[35]体外培养骨细胞MLO-Y4发现,16 T的SMF对细胞突起数量、细胞面积及细胞长度比等无影响,但可提高骨细胞存活率。磁场可促进BMSC向成骨细胞分化,在一定程度上促进成骨细胞迁移、增殖、成熟及基质矿化,并可提高骨细胞存活率。
2.2磁场对骨生成、骨折愈合和骨质疏松的作用 磁场不仅在体外培养的细胞中发挥积极作用,在体内也会产生积极效应。在口腔颌面重建过程中,SMF易于使用且能促进种植体周围骨形成。Naito等[3]将内部携带钕磁体的种植体放置在兔股骨内以研究SMF对骨形成的影响,12周后SMF暴露组骨愈合增强,不仅增加了新骨形成,还显著提高了骨-种植体接触率。Kim等[36]在兔胫骨植入内含磁钛种植体,微计算机断层扫描技术三维重建显示SMF促进了植入物周围骨形成,芯片分析及实时定量聚合酶链反应证实,细胞外基质相关基因(Col10a1、Col9a1和Col12a1)和生长因子相关基因(结缔组织生长因子和人血小板衍生生长因子D)的表达上调,参与成骨或成骨细胞分化的促分裂原活化的蛋白激酶和Wnt信号通路在种植体愈合过程中发挥积极作用,此外细胞外基质相关基因的上调也促进了骨愈合。
1974年,有研究者发现电磁场可加速骨折愈合,并增加骨折间隙的稳定性和刚度[2]。Oltean-Dan等[4]也发现PEMF促进了截骨大鼠股骨愈合,与未采用PEMF治疗的对照组相比,持续2周PEMF治疗的实验组大鼠骨折缺损完全被间充质结缔组织、透明软骨和新生骨填充,并与骨折缺损的两端结合。Aydin和Bezer[37]在兔股骨髓腔植入磁棒证实,SMF能促进骨折愈合,但对骨密度影响较小。SMF促进骨折愈合的可能机制为增加骨折部位的血流量,聚集氧气和营养物质,清除缓激肽和前列腺素等炎症物质,从而加快整个愈合过程。并且,在磁场刺激下贴壁成骨细胞数量增加,钙离子与骨折处血块的黏附性显著增强,这对骨痂形成和骨折愈合有积极影响[38]。
用后肢悬吊模拟失用性骨质疏松发现,PEMF增加了骨小梁厚度、缓解了皮质骨微结构恶化,降低了股骨力学性能,提高了血清骨形成标志物(如骨钙素和Ⅰ型前胶原N端肽)的水平,并通过Wnt信号转导通路促进间充质干细胞向成熟成骨细胞分化,以增加细胞的合成代谢活性,从而减轻失用性骨质丢失[39]。Zhang等[5]发现,全身暴露SMF持续16周可抑制链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨小梁和皮质骨结构退化以及机械强度的降低,并增加血清骨钙素的水平以及骨形态发生蛋白2、骨钙素和Runt相关转录因子2基因的表达,从而防止糖尿病引起的骨质疏松、骨结构恶化和骨质量下降。可见,磁场可促进植入体周围骨生成,对骨折愈合和骨质疏松有积极影响,对骨病有潜在的辅助治疗作用。
机体与磁场相互作用的物理机制为:①电动相互作用。骨基质中的胶原蛋白带负电,而带正电的阳离子游离于骨髓间隙的液体中;此外细胞膜内为负电荷,膜外为正电荷。在磁场作用下带电离子发生定向移动,导致细胞内磁通量变化而产生感应生物电流[40],进而对跨膜蛋白信号转导产生一定影响,引发信号级联反应[41],从而影响软骨和骨细胞的结构和功能。②磁机械相互作用。骨组织胶原纤维和无机羟基磷灰石具有抗磁性,但磁化系数比较小,约为10-5,若磁梯度足够大可使胶原和成骨细胞沿磁场方向定向排列[38],这也为未来组织工程干细胞定向迁移提供可能。③自由基对效应。中等强度磁场可改变自由基反应的速率、产率或产物分布[39],有研究表明鸟类在依靠地磁飞行时,自由基对理论,发挥重要作用[42],但目前尚不清楚磁场是如何通过该理论对软骨和骨组织发挥生物学效应。
磁场在抑制骨关节炎进展、促进骨骼生长发育、治疗某些常见骨病和骨再生医学中起着积极作用。磁场在维持骨健康和骨病治疗中具有广阔的前景。但由于研究有限,磁场暴露导致的生物学效应并不一致,如磁场刺激后软骨细胞和成骨细胞增殖反应不一,这可能取决于磁场强度、磁场暴露持续时间、细胞类型及治疗的组合等,需对一系列参数进行系统分析,找出原因。磁场对软骨和骨组织的确切作用机制尚不清楚,需进一步研究。未来为更全面地研究磁场对骨骼系统的影响,磁强度应从低到高、从体内到体外、从实验室研究到临床试验进行更加系统的研究。