芒果组织培养研究进展

王素杰，李 凤，员 楠，张汉尧

(西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650224)

芒果(MangiferaindicaL.)是一种原产于印度的漆树科(Anacardiaceae)杧果属(Mangifera)常绿大乔木，又名望果、蜜望、莽果、抹猛果。广泛分布于亚热带和热带地区，中国的芒果资源十分丰富，其产区主要集中在广西、广东、云南、福建、海南等省份。芒果肉质细腻、风味独特，享有“热带水果之王”的美誉，与苹果、香蕉、柑桔、葡萄齐名世界五大水果，是亚热带和热带地区的主要经济作物之一。早在1982年，学者开始探索芒果组织培养的技术，美国学者Litz R.E.等[1]最先通过分离芒果的胚珠进行组织培养，获得了体细胞胚。1989年，Dewald等[2]以Paeeis和James Saigon 2种多胚芒果的珠心组织为外植体，在改良的B5培养基中诱导获得了体细胞胚，继续培养得到了完整植株。1995年，Raghuvanshi等[3]报道了从Amrapali芒果的嫩叶中诱导出愈伤组织并成功得到完整植株。20世纪90年代以来，我国的许多学者也相继开始了芒果组织培养的研究工作，目前该技术达到一定水平，在芒果愈伤组织的增殖，早期体细胞胚的发生等诸多领域建立了离体再生体系。本文对近年来芒果组织培养技术的研究概况及应用进展进行阐述，以期为芒果遗传改良、种质资源保存和创新提供参考。

1 外植体的选择

1.1 外植体的来源

由于植物的胚珠和珠心细胞是不含病毒的，所以在芒果组织培养中，大多利用芒果的胚珠和珠心做为外植体，同时对其它器官和组织也进行过再生研究[4]。黄镜浩等[5]以扁桃芒未成熟的珠心组织为外植体，接种在改良的B5培养基上，培养35 d左右，长出少量的胚性愈伤组织；再经过90～120 d的成熟培养，发育成乳白色的成熟体胚，最终有3个体胚萌发成苗。最近也有学者利用芒果的其它组织和器官诱导成功的报道。肖洁凝[6]研究发现，以芒果树的顶芽、花枝、叶柄、幼果和子叶节等外植体诱导不定芽时，只有子叶节能诱导出腋芽，在IBA培养基上继续诱导可以生根。而吴永杰[7]以紫花芒和红芒的子叶和胚珠作为外植体的研究中，发现子叶外植体的胚性培养物诱导率明显高于胚珠外植体。王晓峰等[8]以离体胚轴为外植体，在DK和WPM培养基上可以正常成苗。因此，外植体的选择应从植物的取材部位、消毒难易程度等诸多因素加以考虑。

1.2 外植体的消毒

外植体的消毒是组织培养中的重要环节。对于消毒剂的选择既要考虑杀菌效果，又要考虑清洗难度，还要尽可能的使外植体组织保持活力。常见的消毒剂有70%～75%酒精、2%次氯酸钠溶液、0.1%～1%的氯化汞溶液等。采用胚珠或珠心细胞作为外植体时，由于它们是无毒的，所以只需将芒果果实表面进行消毒即可。消毒过程如下：先用70%的乙醇浸泡10 min，再用滴加2～3滴吐温-20的1%次氯酸钠溶液处理20～30 min，然后用无菌双蒸水清洗2～3遍，最后无菌取出胚珠或珠心细胞即可[9]。Raghuvanshi等[3]采用Amrapali芒果的嫩叶做为外植体，带回实验室后，先用自来水冲洗30 min，然后用1%吐温-80浸泡5 min，用无菌水冲洗数次，之后用70%酒精处理30 s，0.05%氯化汞处理2 min，最后用双蒸水至少冲洗5次；消毒处理后再用不同植物生长调节剂和培养基培养，存活率最高达36%。不同材料对消毒剂的敏感程度不同，通常叶片消毒繁琐。因此，在消毒步骤中，应根据外植体的采集部位、大小等因素选择合适的消毒剂和消毒时间。

2 培养基和植物生长调节剂的选择

2.1 培养基

不同的外植体材料所需营养不同，所以选择合适的培养基配方显得尤为重要。一般而言，幼胚做为外植体时，常用改良的B5培养基[9-14]，也有使用WPM、MS等其它培养基的报道[1，15-16]。不同的外植体在不同种类的培养基上生长状态不同。王晓峰等[8]比较了以芒果离体胚轴为外植体，在DK、MS、1/2 MS、WPM 4种基本培养基中的成苗情况，结果显示仅在DK和WPM培养基中能正常成苗。Raghuvanshi等[3]在对芒果的嫩叶进行培养时，先将嫩叶置于液体MS培养基上预培养，以减轻酚类物质对外植体的抑制效果；然后再转接到固体MS培养基上，可以长成完整植株。此外，利用芒果的珠心作为外植体培养时，研究人员先用1/2 MS培养基进行预培养，然后再转入改良的B5培养基进行培养，也获得了再生植株[17]。

2.2 植物生长调节剂

在植物组织培养过程中，不同种类和浓度的植物生长调节剂以及配比，都会影响植物组织和器官的正常生长。常见的植物生长调节剂有2，4-D、NAA、6-BA等，2，4-D有利于植物愈伤组织的生长，而后两者有利于植物器官的分化。有研究表明，2，4-D 0.5 mg·L-1时，有利于芒果愈伤组织的形成[17]。在增殖培养过程中，细胞分裂素KT最适质量浓度为5 mg·L-1，高浓度的2，4-D不利于愈伤组织的增殖分化，因此应降低其浓度或去除[18]。张越阳[19]研究表明，将培养基中2，4-D浓度减半可以使愈伤组织增殖情况变好。

3 培养条件

3.1 光照

光照是植物生长和发育的必要条件之一，适宜的光照可以延长愈伤组织的保存时间。研究表明，愈伤组织培养所需的最适光照强度为1000 Lx，16 h·d-1；而再生植株幼苗则需要更强的光照，为1500～3500 Lx，16 h·d-1；光照强度的增强其成活率和生长速度也随之提高[1，9，20]。

3.2 pH值

培养基的酸碱度过高或过低都会引起植物组织生长不良，最终导致外植体死亡。一般认为，木本植物组织培养的最适pH为酸性。研究表明，适合芒果组培的pH值在5.7～5.8之间[20-21]。

3.3 碳源

蔗糖是植物组培中的重要碳源，同时可以调节植物细胞的渗透势。芒果组培中，不同生长阶段所需要的蔗糖浓度不同，质量浓度一般在20～60 g·L-1之间，芒果外植体诱导愈伤组织时所需的蔗糖质量浓度常规是60 g·L-1[1，14，20-22]。VLaxmi等[23]在研究芒果胚胎发生时发现，使用不同的蔗糖浓度，胚胎萌发情况不同，蔗糖质量浓度为60 g·L-1时，萌发比例可达28.3%，质量浓度为30 g·L-1时的萌发率最低。Xiao等[20]用Zi-Hua芒果为实验材料培养再生植株时，蔗糖质量浓度用40 g·L-1同样取得了不错的效果。

4 芒果组织培养中存在的问题

4.1 污染

污染是指在组织培养过程中，培养材料或培养基上滋生细菌、真菌等微生物的一种现象。污染主要来自3个方面：一是由于外植体材料表面或内部所带的病毒、类菌原体等微生物消毒不彻底，随着材料带入培养[24]；二是接种和培养环境不清洁，再加上接种工具消毒不彻底都会造成污染的问题；三是接种人员操作不规范，接种过程中大声说话，手接触培养容器边缘等。因此，尽可能选择在人工气候箱或温室培养的材料，选择合适的消毒方法彻底消毒，严格按照规范进行操作以降低污染。农艳丰等[25]在芒果茎段的组织培养中，为了减少污染，先将芒果胚埋进消毒的沙床上进行催芽，待长出的苗高15 cm后，剪去茎段做为外植体，再进行消毒处理，这样可显著降低材料的污染率。

4.2 褐化

褐化是指在组织培养中外植体变成褐色从而死亡的现象，是组培过程中普遍存在的问题。研究表明，向培养基中添加吸附剂和抗氧化剂可以有效的控制褐化[26]。Raghuvanshi等[3]将消毒后的芒果幼叶接种到添加0.05% PVP的MS液体培养基中，放在摇床上震荡培养并定时更换培养基，结果发现外植体褐化显著减少，存活率提高到36%。黄镜浩等[5]研究发现，继代培养基中降低2，4-D浓度，同时添加Vc 50 mg·L-1，并与成熟培养基交替使用，可有效地降低褐化率。农艳丰等[25]探索不同防褐化措施的防治效果，结果表明添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的培养基中外植体褐化率最低，比添加AC或Vc的培养基效果要好。王晓峰等[8]在对芒果离体胚轴的培养试验中发现，MS和1/2 MS液体培养基中诱导的胚轴褐化严重，最终导致死亡，而在DK和WPM液体培养中褐化不显著，可以诱导成苗。

5 展望

植物组织培养技术可以缩短繁殖周期，在苗木快繁、花药培养和培养脱毒苗等方面广泛应用。组织培养在芒果繁育上有了一定的进展，但是在酚害控制和生根诱导领域的相关技术不够成熟，应积极攻克芒果组织培养中存在的难题，不断完善芒果组织培养体系，可望为芒果优良品种的保存和遗传转化提供技术支持。