中性粒细胞胞外诱捕网在炎症性疾病中的研究进展

李福兴, 张自华, 李雪梅综述, 赵卫东审校

0 引 言

中性粒细胞是机体的免疫防御细胞，作为机体抵御外来病原体侵入的第一道防线，其有一种特殊的细胞死亡形式[1]，在某些细胞因子、病原体或某些化合物的刺激下，活化的中性粒细胞可向细胞外释放去聚化的染色质，形成网状结构，该网状结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)，而产生NETs的过程则被称为NETosis[2]。NETs不仅可包裹及杀伤外来入侵病原菌起到抗炎作用，还可作为一种自身抗原，发挥促炎作用，导致多种急慢性炎症反应的发生[3]。目前，大量研究表明NETs在肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病及感染性疾病等炎症性疾病(inflammatory diseases, ID)中发挥了重要作用[4]。本文就NETs及其在ID发生发展中作用机制的研究进展作一综述。

1 NETs

早在2004年，Brinkmann等[5]提出了NETs的概念，这是一种新型中性粒细胞死亡形式，其与凋亡和坏死最大的不同是NETs细胞死亡的整个过程染色质是完整连续的，并不出现染色质固缩等现象[6]。活化的血小板、佛波酯、脂多糖、病原菌等均可促进NETs的形成，这一系列细胞事件精细调控的结果即NETosis。在刺激因素作用下，中性粒细胞细胞质颗粒和核膜发生溶解，进而失去其本来的分叶状结构，随后中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PADI4)等在中性粒细胞核内协调组蛋白高聚亚氨酸化及染色质去皱，促成细胞质与细胞核含量内容物的融合。最终，中性粒细胞细胞膜破裂，核酸和蛋白混合物释放到胞外形成以核酸为骨架附着大量颗粒蛋白的NETs[7-8]。

2 NETs机制

2.1 经典途径在脂多糖和肿瘤坏死因子诱导下，中性粒细胞内容物被挤出，中性粒细胞发生核物质扩散，染色质浓缩，核包膜崩解等过程，随后细胞质和核组分的混合，质膜破裂，染色质释放。这一过程依赖Raf-MEK-ERK途径激活NADPH氧化酶，产生活性氧(ROS)，进而激活受体相互作用蛋白激酶-3—混合谱系激酶样级联反应。而这种类型的NETs形成是由补体系统，TLR2和(或)纤维连接蛋白启动的，染色质以胞内囊泡的方式，以完整的质膜从细胞释放[9]。

2.2 Gasdermin D途径最新研究发现，Gasdermin D蛋白可引发细胞焦亡和NETs[10]。在正常细胞条件下，Gasdermin D蛋白保持全场的无活性状态，当细胞受到脂多糖等刺激后，Gaspermin D则被半胱氨酸蛋白酶或中性粒细胞弹性蛋白酶切，然后，新释放的Gasdermin D的N端部分发生寡聚反应，在细胞膜上形成一个裂解孔，靶向和溶解中性粒细胞颗粒膜，释放出NE和MPO。这些颗粒蛋白的释放引发核分离、DNA扩散、组蛋白降解、染色质浓缩和核膜渗透。

3 NETs与炎症

中性粒细胞可通过吞噬、释放溶菌酶和形成NETs进而杀灭感染的细菌、真菌，但有研究证实，在机体感染时，NETs也会与细胞毒性、促炎症、促血栓形成等不良事件密切相关[11]；而在血管炎的患者中存在专门针对NETs的抗体[12]；一项针对SARS-Cov-2的大型研究表明NETs会增加患者的器官损伤，甚至死亡[13-14]；在肿瘤患者中，NETs可促进肿瘤转移[15]。综上，NETs在机体内犹如一把双刃剑，既对病原体起到防御作用，但其也会对宿主造成严重损害，其过度浸润和不受控制的激活可能导致正常组织结构的破坏和不受控制的炎症，然而，其确切机制目前仍有待深入研究。

4 NETs与炎症性疾病

4.1 NETs与肿瘤许多实体肿瘤周围浸润着中性粒细胞及其他免疫细胞，该过程往往伴随着炎症反应，同时在小鼠模型中也发现，炎症过程中产生的NETs可唤醒小鼠体内休眠的癌细胞，抑制NETs形成可防止单个播散性癌细胞转化为不断增长的转移性癌细胞[16]。近期NETs在肿瘤中的研究取得重大突破，我国一项研究发现肿瘤细胞膜上的蛋白CCD25可作为 NET-DNA 受体感知胞外DNA，进而介导肿瘤转移的发生，监测血液样本中的 NET-DNA 有望成为评估肿瘤患者预后的一种潜在方法，该研究分析544名乳腺癌患者的原发性和转移性肿瘤中的NETs，发现NET-DNA水平与肿瘤转移至肝脏之间存在着密切关系，并在小鼠肿瘤模型中得到证实，总的而言，该项研究确定了跨膜蛋白CCD25是DNA的特定感受器，而血液中NETs的水平升高可作为早期预测乳腺癌患者肝转移的风险标志物，并通过小鼠模型表明CCD25可作为治疗肿瘤转移的潜在靶点，但目前对CCD25蛋白的功能研究尚不完全清晰，其治疗的可行性仍有待评估[15]。

国外一项研究发现，PADI4是NETs形成过程中最关键酶，以细胞外DNA水平升高为标志的NETs形成促进了胰腺癌的增殖和转移。PADI4基因敲除的胰腺癌小鼠存活率明显提高，该研究表明游离在血液中的中性粒细胞的DNA也与癌症发展有着密切关系，通过敲除PADI4基因可有效抑制胰腺癌的生长，这可能是未来胰腺癌治疗的新靶点[17]。这些研究均表明，NETs与肿瘤的发生、发展和转移过程密切相关。通过监测肿瘤患者血液中的NET-DNA可为肿瘤的转移提供参考依据，评估患者的预后。同时，参与NETs形成过程以及与NETs相互作用的一些生物分子可能成为肿瘤的治疗靶点。

此外，NETs参与肿瘤免疫的机制研究也在进行中。国外团队首先研究了各种趋化因子、补体C5a、脂多糖等诱导中性粒细胞和GR-MDSC产生NETs的能力，随后提出CXCR1和CXCR2是诱导NETs产生的最重要受体的假设，并进行了验证。体外研究发现激活CXCR1和CXCR2确实可诱导NETs的大量产生，使用CXCR1/R2抑制剂Reparixin后可完全抑制NETs的产生，进一步在小鼠肿瘤模型中，可阻止NETs形成的PADI4抑制剂GSK484，能明显增强PD-1抗体+CTLA4抗体的疗效，且该机制是通过CD8+T细胞实现的。该研究揭示NETs参与肿瘤免疫的机制，为相关趋化因子受体靶点药物的开发提供了理论依据[18]。另一项研究发现弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)患者血浆和肿瘤组织中NETs水平升高与预后不良有关。机制上，DLBCL来源的IL-8与其受体(CXC receptor 2, CXCR2)在中性粒细胞上相互作用，通过Src、p38和ERK信号通路形成NETs。新形成的NETs直接上调DLBCL中的Toll样受体9(Toll-like receptor 9, TLR9)通路，随后激活NFκB、STAT3和p38通路以促进肿瘤进展。同时，在小鼠模型中破坏NETs、阻断IL8-CXCR2轴或抑制TLR9可延缓肿瘤的进展[19]。以上研究均表明NETs参与肿瘤免疫，NETs的产生与CXCR密切相关，进一步揭示了肿瘤与NETs的相互作用，表明NETs是肿瘤潜在的预后生物标志物，并为肿瘤的免疫治疗提供了思路。

4.2 NETs与自身免疫性疾病研究表明NETs参与了自身免疫性疾病的发病进程，国外一项研究在ANCA相关血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)患者的肾组织中检测到NETs，发现在髓过氧化物酶诱导下会触发NETs进程，并且发现在ANCA活动期，NETs生成过度，且NETs水平与血清ANCA水平无关，说明NETs水平升高与AAV活动性相关，可更好的指导临床用药[20]，此外还有研究发现AAV患者和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者均具有过量的NETs形成，且这与疾病活动程度相关，但是两者的机制并不相同，AAV依赖于ANCA的IgG抗体，进而诱导NETs形成，而SLE免疫复合物通过Fcγ受体信号传导诱导NETs形成，这说明NETs在自身免疫性疾病中机制的多样性，需要更多的实验研究来探索[21]。这些研究均表明，在AAV等自身免疫性疾病的发病进程中会诱导NETs形成，其可能作为一种生物标志物来跟踪疾病的进展，为临床用药提供指导。

在我国一项针对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的研究中，发现RA患者的MPO-DNA复合物水平显著高于健康对照组，其水平与中性粒细胞计数的升高以及类风湿因子和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体阳性率有关，该研究还发现RA的活动状态与NETosis的增加有关，血清MPO-DNA水平可有效区分RA患者与健康人[22]。有研究还发现针对NETs的自身抗体有可能成为类风湿关节炎的血清生物标志物[23]。最新一项研究则发现NETs中存在的中性粒细胞弹性蛋白酶既可降解软骨，又可刺激由成纤维细胞样滑膜细胞介导的下游炎症反应，因此，抑制NET形成或阻断NET中存在的相关分子的作用途径可能是RA及其相关器官损害的有用治疗方法[24]。以上多个研究表明，NETs可能在类风湿性关节炎的发生和活动中发挥作用，相关抗体也为RA的诊断和治疗提供参考依据，但需要更多机制性研究提供理论依据。

4.3 NETs与心脑血管疾病NETs与心脑血管疾病的研究也在进行中，研究发现miR-146a通过调节NETs的生成，可用来预测心房颤动患者的不良预后[25]。我国一项针对冠状动脉扩张症的研究发现，这些患者的外周血中性粒细胞在IL-1β和可溶性粘附分子的刺激下被激活，从而NETs升高[26]。另外，载脂蛋白E可通过ROS-MAPK-MSK1途径调节NETs形成，在载脂蛋白E缺乏的小鼠模型中证实NETs过度生成可加剧小鼠急性心肌梗塞造成的损伤[27]。NETs同样参与了缺血性脑梗死的进程，当机体发生缺血性脑梗死时，中性粒细胞浸润在受损的脑细胞旁，可加剧炎症，在高迁移率族蛋白B1诱导下，可促进NETosis，在小鼠模型中使用NETosis抑制剂时，不仅延缓了免疫细胞浸润，而且显著减轻了血管损伤[28]。以上研究表明NETs可能参与心脑血管疾病的发病及进展，这为心脑血管疾病的发病机制提供参考依据和研究方向，NETs抑制剂可能成为治疗心脑血管疾病的新药物。

4.4 NETs与糖尿病近期，NETs在糖尿病中的研究也取得一定突破，高血糖可在中性粒细胞参与下诱发血管功能障碍，甚至加剧缺血性脑梗死所造成的损伤[29]。我国最新研究发现MFG-E8通过调节“NLRP3炎性小体-NETs”轴加速糖尿病的伤口愈合[30]。NETs的形成可导致2型糖尿病小鼠模型的血管损伤[31]。2型糖尿病可能与高凝状态和NETs增加有关[32]。此外，1型糖尿病患儿的NETs构成与健康人不同，其外周血单核细胞中的T1D-NET复合物可诱导细胞因子生成，促进T淋巴细胞产生IFN-γ，还发现NETs诱导的树突状细胞活化可导致1型糖尿病的Th1极化，为治疗1型糖尿病提供新靶点[33]。增生性糖尿病视网膜病变的患者中的中性粒细胞在无菌炎症晚期的血管重构中发挥其非常规的作用，衰老的脉管系统会分泌吸引中性粒细胞的物质，并诱导其产生NETs，最终清除病变的内皮细胞，重构不健康的血管，此研究亦为治疗糖尿病相关视网膜病变开辟新方向[34]。以上研究表明在糖尿病患者中，NETs的形成和增加会对机体血管和免疫系统造成不同的影响，这可能与疾病的发病机制差异以及NETs产生的数量有关，需要更进一步的疾病机制研究以明确NETs在不同亚型糖尿病中的作用及影响，为疾病的治疗提供帮助。

4.5 NETs与感染性疾病NETs最初被认为是一种抗菌机制[5]，近期其在感染性疾病中的研究有了新发现，国外一项研究证实增强机体NETs的活性，使其更有效捕获传染性细菌，从而可最终改善脓毒症的症状以及生存率[35]。而目前在全球大流行的新型冠状病毒，NETs在其作用机制中发挥了不可替代的作用，研究发现中性粒细胞诱导的氧化应激反应，尤其是NETs的产生，会造成机体急性肺损伤、血栓形成等严重损害[14]。还有研究发现破坏性的白细胞与COVID-19患者的病程更严重之间存在联系[36]。最新研究则发现针对纤溶酶原和NETs相关的中性粒细胞弹性蛋白酶的抗蛋白酶治疗可能有利于治疗新冠肺炎[37]。这些研究表明NETs可能作为新冠肺炎治疗的一个潜在靶点，其在COVID-19中的作用机制仍有待进一步研究。

5 结 语

随着研究的越来越深入，更多关于NETs的机制在不断被揭示，其与炎症反应关系密切，参与了肿瘤、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、糖尿病及感染性疾病等ID的疾病进程，但具体机制仍有待探究。现有研究表明，NETs参与了ID的发生和发展，其在疾病进展中的产生和增加使其DNA和相关抗体有望成为一种有助于疾病诊断和预后判断的生物标志物，与NETs产生以及相互作用的相关分子及通路将可能成为ID的治疗靶点。综上所述，NETs在炎症性疾病中具有重要作用，研究需更加深入，为早日攻克炎症性疾病提供理论依据和转化策略。