温针灸对消化不良性腹泻大鼠结肠黏膜水通道蛋白3、4表达的影响研究*

范晓艳，何 峰，韩 昭，王雅楠

(陕西省康复医院，陕西 西安 710065)

慢性腹泻(Chronic diarrhea)是儿科常见疾病，以消化不良性腹泻为主[1]。该疾病多发于2岁以下儿童，主要由于过量饮食，导致肠胃负担增加，加之小儿脾胃功能尚未发育成熟，若消化系统长期处于负重状态，很容易引起消化不良，严重时会发生腹泻[2]。患儿临床症状为腹泻、腹胀、大便过频且呈稀糊状，若未得到及时治疗，会导致脱水、电解质失衡和菌血症等并发症，严重影响儿童生长发育[3]。中医学名归属为“久泻”，以湿邪困脾、脾湿健运为主要病机。中医治疗慢性腹泻以补益脾胃、化湿止泻为基本原则[4]。温针灸是针刺与艾灸相结合的一种中医疗法，通过温热效应和光辐射共同作用于患处，具有温通经脉、行气活血的作用，促进患处相关功能的恢复。本研究通过对消化不良慢性腹泻小鼠模型特定穴位进行温针灸治疗，观察其疗效，从分子和细胞水平探索温针灸对于消化不良慢性腹泻的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5周龄健康SD大鼠20只，雄性，体质量90 g左右，购自第四军医大学实验动物中心。实验大鼠在室温(24±3)℃，光照12 h，湿度(45±5)%，自由饮食条件下，适应性观察3 d。分笼喂养，称体质量。将20只大鼠随机分为A、B、C、D 4组。A组：空白组(5只)；B组：模型组(5只)；C组：温针灸1个疗程组(5只)；D组：温针灸2个疗程组(5只)。

1.2 实验主要试剂和器材

逆转录试剂盒(日本Takara公司)；兔多克隆抗体AQP-3及AQP-4一抗、羊抗兔AQP-3、AQP-4二抗(美国Abcam公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；电泳仪、电转仪、化学发光凝胶成像系统和石蜡切片机(美国Bio-Rad公司)；台式高速冷冻离心机(美国Beckman)；酶标仪(美国BioTek公司)；一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm，由苏州医疗器械有限公司提供)；艾粒[12 mm×15 mm，(0.7±0.07)g/粒,由上海泰成科技发展有限公司提供]。

1.3 模型制备

参考刘舒[5]的方法，空白组(A组)饲料不变，将B、C、D组基础饲料中的葡萄糖全部改为乳糖，其余成分保持不变，即为高乳糖饲料。SD大鼠高乳糖饲料喂养，饮水采用灭菌纯净水。所有实验大鼠均自由进食和饮水。每日同一时间进行体质量、饮水量测量和大便观察。观察大便的性状、颜色和大鼠精神状态。对每只大鼠每天的稀便、干便进行计数，用分规和刻度尺测量每一稀便污迹的直径，根据直径可分为4级：<1 cm为1级，1～1.9 cm为2级，2～3 cm为3级，>3 cm为4级。以腹泻率和腹泻指数作为评判腹泻的主要指标。稀便率=每只动物所排的稀便数÷该动物总便数；腹泻指数=稀便率×平均稀便级。腹泻指数为3～4即建模成功。

1.4 干预方法

模型建立成功后，每组均给予正常饮食。A空白组和B模型组均不予治疗；C组给予温针灸，1次/d，治疗周期为5 d；D组给予温针灸，1次/d，治疗5 d后休息2 d，再行针灸5 d。针灸部位：天枢、关元、中脘配足三里[6]。温针灸方法：将大鼠用自制固定器固定，使其仰卧，75%乙醇将施针穴位周围消毒3遍，右手持针垂直刺入5 mm，得气后将艾粒置于针柄，从下端点燃艾粒，每穴每次灸2壮，燃尽起针。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 各组大鼠腹泻情况 观察并记录模型组大鼠及温针灸组大鼠活动状态及排便情况。

1.5.2 Western blot检测水通道蛋白3(Aquaporin-3,AQP-3)、水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP-4) 治疗结束后处死大鼠，剖腹，取2 cm结肠中段。使用RIPA裂解液在冰上提取组织总蛋白，蛋白质定量检测试剂盒测定所得总蛋白浓度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，PVDF膜快速转印1.5 h，5 %脱脂奶粉封闭液封闭2 h，TBST洗膜5 min，重复3次，分别加入AQP-3、AQP-4一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min，重复3次，加入相应HRP标记二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜5 min，重复3次，ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为蛋白表达结果，进行统计分析。

1.5.3 qPCR法检测AQP-3 mRNA、AQP-4 mRNA的表达 治疗结束后处死大鼠，剖腹，取2 cm结肠中段组织，称取50 mg于液氮中研磨成粉。置于离心管中，加入1.5 mL BB4及75 μL Proteinase K溶液，轻摇混匀后置于56 ℃水浴锅15 min。之后12 000 r/min离心5 min，取上清1 mL转移至RNase-free离心管中。向RNase-free离心管上清中加入1 mL 70%乙醇，彻底混匀后，12 000 r/min离心30 s后，弃上清。提取RNA。检查RNA纯度和含量后，采用qPCR法，检测AQP-3 mRNA和 AQP-4 mRNA含量，并计算其相对表达量。

1.5.4 ELISA法检测大鼠结肠粘膜组织细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8及IL-10的表达 治疗结束后处死大鼠，剖腹，取2 cm结肠中段组织样本，加入0.02 M浓度 PBS(PH 7.4)溶液，研磨成5%组织匀浆，静置10 min，3 500 r/min速度，4 ℃离心20 min，取上清液储存于-20 ℃冻存待测。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测组织中TNF-α、IL-6、IL-8及IL-10含量。

1.5.5 免疫组化检测AQP3和AQP4阳性细胞表达 于温针灸结束后，麻醉断颈处死，剖腹，取2 cm结肠中段。用4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，在显微镜下于结肠黏膜、肠绒毛处选取3个高倍视野(400×)，对AQP3和AQP4阳性细胞进行计数并拍照，应用Image Pro Plus 6.0图文分析系统检测平均光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠腹泻情况

模型大鼠大便溏泄、食欲差及活动减少，并出现消瘦现象。开始治疗后，治疗组模型大鼠腹泻情况有所缓解。不同疗程温针灸组腹泻指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同疗程温针灸对大鼠腹泻指数的影响

2.2 Western blot检测温针灸对大鼠结肠黏膜水通道蛋白AQP-3、AQP-4相对表达的影响

与模型组比较，温针灸1个疗程和温针灸2个疗程组AQP3和AQP4蛋白的相对表达量均上调。同时，温针灸2个疗程组AQP3蛋白相对表达水平高于温针灸1个疗程组和空白组，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组AQP3、AQP4蛋白表达

图1 不同疗程温针灸对大鼠结肠黏膜水通道蛋白AQP-3、AQP-4表达的影响

2.3 温针灸对大鼠结肠黏膜水通道蛋白AQP-3 mRNA、AQP-4 mRNA相对表达的影响

模型组AQP3 mRNA和AQP4 mRNA相对表达量均低于空白组、温针灸1个疗程和温针灸2个疗程组，温针灸2个疗程组AQP3 mRNA相对表达水平高于空白组，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。温针灸2个疗程组AQP3 mRNA和AQP4 mRNA相对表达量高于温针灸1个疗程组，但两者差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

图2 各组AQP3 mRNA、AQP4 mRNA扩增曲线图

表3 各组AQP3 mRNA、AQP4mRNA相对表达变化

2.4 不同疗程温针灸对大鼠结肠黏膜TNF-α、IL-10、IL-6及IL-8表达的影响

与模型组比较，温针灸1个疗程组和温针灸2个疗程组TNF-α、IL-6和IL-8表达降低，IL-10表达升高，除温针灸1个疗程组的IL-8以外，其余差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。且温针灸2个疗程组IL-6的表达低于空白组，IL-10的表达高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同疗程温针灸对大鼠结肠黏膜IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α表达变化

2.5 免疫组化检测 不同疗程温针灸对大鼠结肠黏膜细胞AQP3、AQP4蛋白表达的影响

空白组、温针灸1个疗程组和温针灸2个疗程组光密度值高于模型组，且差异均有统计学意义(P<0.01)。见表5、图3。

图3 各组大鼠结肠黏膜AQP3、AQP4免疫阳性细胞表达情况(400×)

表5 各组大鼠结肠黏膜AQP3、AQP4免疫阳性细胞光密度值变化

3 讨论

针灸是中医领域重要的外治方法之一，其基于整体观念和辨证论治，通过穴位刺激产生生物学效应，具有疏通经络、调理阴阳和扶正驱邪等作用。研究表明，针灸可增加施针部位的血液循环[7]，还可影响针刺部位及所对应脏腑的糖、脂类、蛋白质的代谢及能量代谢[8-9]。广泛用于骨关节、脉管炎和中风后遗症等多种疾病的治疗[10-12]。艾灸作为一种热疗手段，通过温热刺激，激活穴位局部的特异感受器、热敏感免疫细胞等，从而诱发多种局部效应,达到温通温补的作用[13]，并能调节局部穴位组织紊乱的神经递质[14]，从不同层面改善患者的神经和免疫通路，达到治疗疾病的目的。

天枢为胃经之穴，又为大肠募穴，具有敛肠止痛之功；足三里为足阳明胃经的合穴。中医理论认为，脾胃乃后天生化之源，胃腑的正常运转是保证机体抵御邪气的重要基础。温针灸足三里可有效生发胃气，起到维护胃腑的作用[15]；关元归任脉，为足三阴经交会穴，又为小肠募穴，可补肾培元、振奋阳气，舒调肝脾肾3条阴经之气。研究表明，针灸关元穴可增强大鼠能量代谢，有效调节大鼠免疫功能[16-17]；中脘为阳明经募穴，八会穴，可调胃益气。《千金翼方》记载中脘主治病症，如“虚劳吐血，灸胃管三百壮，亦主呕逆吐血，少食多饱及多睡百病”“胸满，饮食不消”[18]。足三里配合中脘穴，对于治疗胃实证、脾实证的干预效果优于单穴[19]。“合主逆气而泻”“五脏六腑之气皆秉于胃”，可以调节中焦、升清降浊，与天枢一起“合募配穴”，共奏调理大肠之功[6]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一类重要的跨膜蛋白，广泛分布于人和哺乳动物体内，可通过促进渗透梯度的扩散，促进液体和小溶质的转运。广义地讲，AQPs的生理功能包括上皮液体运输、液体分泌、神经信号转导、细胞迁移和甘油运输，其与多种调控机制有关，参与机体的生理和病理转归[20]。AQP3分布于小肠末端上皮细胞的顶端和基部，结肠绒毛和表皮的角化细胞[21]，有报道显示，LPS处理的HT-29细胞可通过JNK/p38信号通路下调AQP3的表达，从而改变结肠粪水含量[22]；刺激性泻剂可通过结肠粘膜上皮细胞巨噬细胞活化和肿瘤坏死因子α的分泌间接诱导AQP3表达水平的下降[23]。AQP4除在中枢神经系统表达丰富外，也广泛分布于哺乳动物胃肠道，参与胃肠道水代谢及营养物质的消化吸收。其在肠道主要定位于小肠隐窝细胞和结肠表面上皮细胞的基底外侧膜。Zhang D等[24]在小鼠腹泻模型中可观察AQP4 mRNA及其蛋白水平的下降。Sakai H等[25]报道，5-氟尿嘧啶导致的腹泻小鼠结肠中，AQP4、AQP8基因表达水平显著降低。由此可见，AQP3和AQP4表达的下调可导致结肠水的转运从吸收状态变为分泌状态，从而引起严重腹泻。

本研究对乳糖诱导的消化不良慢性腹泻SD模型大鼠进行不同疗程的温针灸。检测其结肠黏膜AQP3和AQP4蛋白及其mRNA发现，空白组和温针灸组大鼠AQP3和AQP4蛋白及对应的mRNA表达高于模型组，且温针灸2个疗程组高于温针灸1个疗程组。说明腹泻大鼠结肠黏膜AQP3和AQP4蛋白和mRNA的表达降低，而温针灸可显著上调腹泻大鼠的AQP3和AQP4蛋白和mRNA水平，且2个疗程较1个疗程提高更明显。对于提高近端结肠对水的吸收、改善腹泻和脱水症状有较好的疗效。另外，温针灸2个疗程组的AQP3蛋白相对表达量显著高于温针灸1个疗程组，而AQP4蛋白、AQP3 mRNA和AQP4 mRNA在两个疗程中差异不显著，说明AQP3蛋白对于温针灸疗程敏感度高于AQP4蛋白，且不同疗程对于AQP3 mRNA和AQP4 mRNA的表达影响不显著。

腹泻导致肠道组织水肿，除细胞和组织肿胀外，其导致的细胞外体液的聚集，也是炎症反应和内环境紊乱的表现[26]。大量研究表明，在炎症反应中，均存在水通道蛋白的失调[27-28]。本研究结果显示，温针灸1个疗程组和温针灸2个疗程组大鼠结肠组织的TNF-α、IL-6和IL-8较模型组表达降低，IL-10表达升高，说明温针灸可明显改善腹泻大鼠结肠组织的炎症反应。同时，温针灸2个疗程组IL-6的表达明显低于空白组，IL-10的表达明显高于空白组，说明温针灸不仅可改善腹泻，还可将部分炎性因子水平降至正常个体以下，可对机体起到治疗和保健作用。AQP3和AQP4免疫阳性免疫组化染色呈棕褐色，分布于胞质和细胞核内。本研究使用光密度值表示免疫细胞阳性数量，发现温针灸不同疗程组AQP3和AQP4光密度值均显著高于模型组和空白组，说明温针灸有助于提高慢性腹泻大鼠和正常大鼠结肠黏膜的水分和营养物质吸收，对于腹泻和营养吸收具有治疗和改善作用。

综上所述，温针灸可通过上调消化不良慢性腹泻SD大鼠结肠黏膜AQP3、AQP4 mRNA和蛋白表达，达到止泻的治疗效果。同时，上调其炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平，下调IL-10水平，降低正常机体结肠黏膜炎症水平，增强大鼠免疫力，增加结肠黏膜的营养吸收，对机体具有保健作用。