基于肠道菌群研究针刺水沟穴对持续植物状态患者营养状态的影响*

刘烜玮,赵娜娜,肖 鹏,陈嘉敏,文 琼,王玉龙

(1.深圳市大鹏新区南澳人民医院,广东 深圳 518121；2.深圳市罗湖区中医院,广东 深圳 518000；3.深圳大学医学院,广东 深圳 518035)

持续植物状态(Persistent vegetative state，PVS)是指严重脑损伤导致的植物状态持续1个月以上[1]。PVS患者完全丧失对自身及外界的认知功能，但保留自主功能，无任何自发语言及有目的的四肢活动[2]。皮质下无意识活动，对于疼痛或有害刺激可出现痛苦表情或逃避反应，但通常无定位反应[3]。可有无意识的哭叫，有不规则的睡眠-醒觉周期[4]。PVS在中医学中属于尸厥病范围[5]。随着科技的发展，重症监护设备的研发和急救诊疗技术不断提升，急症病人的死亡率已明显降低，但也因此出现了大量的PVS患者[6]。据其他国家统计，PVS发病率在0.03‰左右[7]，美国为0.19‰[8]，推测中国大约有15万PVS患者。该病预后不良，意识、功能恢复较差，致残率和致死率高[9]。国内一项回顾性研究也发现，营养状况差的PVS患者的死亡风险是营养状况好的3.352倍；而持续肠内营养治疗不仅可以改善PVS患者的营养状况，还能改善疾病预后[10]。拥有悠久历史的中医对PVS治疗积累了丰富的治疗经验，成为中西医结合治疗PVS危重症的发展趋势。水沟穴(别名人中穴)为督脉和手阳明大肠经、足阳明胃经的交会穴，具有醒脑开窍、清热通阳、救逆止搐和舒筋利脊的作用[11]。肠道与大脑之间的双向信息交流系统被称为肠脑轴。近年来，越来越多的研究表明肠道菌群可以通过肠脑轴调节大脑的发育和功能，进而影响宿主的行为。因此，医学科学家们提出了“微生物-肠-脑”(Microbiota-Gut-Brain，MGB)轴的概念[12]。“微生物-肠-脑”轴之间的沟通交流表明了来自肠道菌群的信号是如何影响大脑功能的以及大脑是如何影响肠道菌群的活性和胃肠道生理学的。这种双向交流主要通过自主神经系统和肠道神经系统的神经内分泌和神经免疫机制来实现。因此，在“微生物-肠-脑”的双向调节概念的指导下，本研究通过观察针刺PVS患者水沟穴来研究对其营养状况的影响，对于患者的预后判断有积极的作用，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2017年12月—2020年4月在本院植物人促醒科接受治疗的PVS患者76例。其中，男性47例，女性29例，年龄18～80岁，平均年龄(48.32±7.57)岁。利用Excel随机数字分组方法将76例患者随机分为试验组(n=38)与对照组(n=38)。两组一般资料比较,年龄(P=0.810)、病程(P=0.171)、性别(P=0.813)比均差异无统计学意义(P>0.05)，两组病因分别为脑出血、脑外伤、二氧化碳中毒和缺氧脑病(P=0.431)病因比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入标准

①符合PVS诊断标准；②年龄18～80岁；③愿意按照本研究要求只使用肠内营养剂或自制匀浆配方进行营养支持治疗；③BMI为18.5～23.9；④家属或授权委托人同意参加本课题研究并在知情同意书上签字。

1.3 排除标准

①2周内曾应用抗生素、益生菌制剂进行治疗；②并发严重的内分泌和代谢性疾病；③并发严重的肝肾功能障碍；④并发严重心肺功能不全；⑤并发消化道溃疡、出血和严重腹泻不能应用肠内营养制剂；⑥并发风湿免疫疾病；⑦并发恶性肿瘤。

2 治疗方案

2.1 试验组治疗方法

2.1.1 常规治疗 包括基础病治疗及药物促醒治疗，基础病治疗包括降压、降糖、抗血小板凝集、抗凝及他汀类药物治疗；促醒治疗包括溴隐亭、多巴丝肼和金刚烷胺等治疗。

2.1.2 康复训练 包括运动治疗(被动)、吞咽功能训练(被动)、中频脉冲电治疗和气压治疗等。

2.1.3 营养治疗 取含有ω-3PUFAs肠内营养混悬液(enteral nutritional suspension，TPF，能全力，纽迪希亚制药有限公司)，热量按每天25～30 kcal/kg提供。

2.1.4 针刺治疗 水沟穴属于督脉，位于人中沟的上1/3与中1/3的交点处。操作：患者取仰卧位，采用75%酒精消毒皮肤后，选用一次性使用的无菌不锈钢毫针(规格为0.30 mm×25 mm)进行针刺。方法向上斜刺15 mm，1次/d，每次留针30 min，期间每10 min行针1次，行针方法采用均匀提插捻转行针法，捻转角度180°，提插幅度在上下1 mm，频率均为60 r/min。

2.2 对照组治疗方法

常规治疗+康复治疗+营养治疗，均同试验组。疗程均为1个月。

3 观察指标

3.1 肠道菌群及代谢产物检测

本研究关于样品收集方面采取治疗前后收集所有受试者粪便样本。提取样本肠道菌群DNA。16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增及Mseiq文库构建测序：参照仪器说明书，采用双端PE300策略测序，并利用仪器自带软件进行图像分析和数据转化过程。

3.2 肠道菌群基因数据分析

采用QIIME软件计算Alpha多样性指数包括Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数。

3.3 肠道菌群代谢产物定量检测

采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术进行定量粪便代谢产物检测。

3.4 营养状态评估

于治疗前后检测所有受试者血清白蛋白、前白蛋白及血红蛋白水平。所有受试者于治疗前后及随访的第30 d、90 d行营养风险筛查表(nutrition risk screening 2002，NRS2002)，欧洲肠外肠内营养学会(ESPEN)于2002年在德国慕尼黑年会的大会主题报告，2003年在《临床营养》杂志发表，ESPEN“指南”推荐)评定。因PVS患者无法称量体质量，以清晨空腹血清白蛋白<30 g/L认定为存在营养不良风险(营养风险评估为3分)。

4 统计学处理

5 结果

5.1 Mesiq测序结果

试验组coverage指数(0.998 5±0.002 2)，对照组coverage指数(0.997 9±0.001 9)，两组coverage指数均>0.99，表明样本中序列未被测出的概率较低，测序结果可反映粪便样本的真实情况。肠道菌群Alpha多样性分析：治疗前两组Alpha多样性比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后试验组和对照组Chao指数、Ace指数和Shannon指数与本组治疗前比较均显著增高(P<0.05)，Simpson指数显著降低(P<0.05)。且试验组粪便菌群Chao指数、Ace指数和Shannon指数均显著高于对照组(P<0.05)，试验组Simpson指数显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组治疗前后肠道菌群多样性比较

5.2 肠道菌群变化情况

治疗前两组拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属(Prevotella)以及柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)等细菌相对丰度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后试验组Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium和梭菌属(Clostridium)的相对丰度与治疗前比较均显著增高(P<0.05)，而肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonodaceae)和罗尔斯通菌属(Ralstonia)的相对丰度均显著下降(P<0.05)。治疗后对照组Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium、Clostridium的相对丰度与治疗前比较均显著增高(P<0.05)，Enterobacteriaceae、Pseudomonodaceae、Ralstonia的相对丰度均显著下降(P<0.05)。治疗后试验组肠道菌群的相对丰度与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组治疗前后肠道菌群变化

5.3 肠道菌群代谢产物

粪便样本中短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)主要为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。比较四种化合物的峰面积，乙酸含量最高，戊酸含量最低。治疗前两组肠道菌群代谢产物乙酸、丙酸、丁酸和戊酸比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后试验组乙酸、丁酸和戊酸含量与治疗前比较均显著增高(P<0.05)，丙酸含量显著降低(P<0.05)。治疗后对照组乙酸、丁酸和戊酸含量与治疗前比较有所增高，丙酸含量有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后试验组与对照组比较，肠道菌群代谢产物差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组治疗前后肠道菌群代谢产物峰面积百分比比较

5.4 营养评估

治疗前两组血清白蛋白、前白蛋白及血红蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组上述血清营养指标与本组治疗前比较均显著增高(P<0.05)，且试验组显著高于对照组(P<0.05)。见表4。治疗前两组NRS2002评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且两组NRS2002评分均>3分，应进行营养支持。治疗后试验组NRS2002评分与治疗前比较显著降低(P<0.05)，而对照组NRS2002评分与治疗前比较有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，试验组NRS2002评分与对照组比较显著降低(P<0.05)。随访第30天时，两组NRS2002评分与本组治疗前、治疗后比较均显著降低(P<0.05)，且试验组显著低于对照组(P<0.05)。随访第90天时，两组NRS2002评分与本组治疗前、治疗后及随访第30 d比较均显著降低(P<0.05)，且试验组显著低于对照组(P<0.05)。见表5。

表4 两组治疗前后血清营养指标比较

表5 两组NRS2002评分比较

6 讨论

肠道微生物群是一个庞大的微生物群体，构成了机体肠道微生态系统，直接影响着机体健康。肠道为微生物群提供栖息地及其所需营养物质，下调免疫反应以形成免疫耐受，促进其在肠道内定植。“微生物-肠-脑”轴是一个把宿主肠道与大脑活动结合起来的双向应答系统，并为肠道菌群及其代谢产物提供了一个进入大脑的潜在途径[13]。近年来，基于“微生物-肠-脑”轴理论，“从脑治肠”的研究逐渐增多，且疗效颇佳，但关于针灸相关的临床研究却相对欠缺。中医脏腑理论认为脑与肠之间关系密切，胃肠系统的异常会影响脑功能并诱发痴呆、健忘和神机异常等多种脑病，反之脑功能的异常也可影响胃肠的正常吸收营养的功能。故通过调节脑功能来治疗胃肠功能紊乱或低下具有中医理论依据[10]。水沟穴(别名人中穴)为督脉和手阳明大肠经、足阳明胃经的交会穴，具有醒脑开窍、清热通阳、救逆止搐和舒筋利脊的作用[14]。中医理论中，针灸水沟穴可通过调节肠道微生物群治疗肥胖、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、心血管病及脑病等多种疾病。研究发现，合理的营养支持是保证植物状态患者改善负氮平衡，增进机体免疫功能，促进患者康复的基础[9]。有研究显示，针刺疗法可以通过调节参与SCFAs和中链脂肪酸生成的菌群丰度以及与机体炎症反应相关的菌群结构等方式改善2型糖尿病患者肠道菌群结构紊乱[15]。

PVS患者认知功能丧失，无吞咽能力，且患者昏迷时间较长，呈高分解、代谢状态，存在负氮平衡。营养不良会导致患者免疫力低下，易造成感染、胸腔积液和压疮等并发症，生存极为困难。有研究发现，营养不良是PVS患者感染的危险因素，是PVS患者预后不良的独立危险因素[16]。也有学者指出，存在肺部感染的PVS患者的死亡风险是无肺部感染的3倍左右[17]，营养状况差者的死亡风险是营养状况良者的4倍左右[18]。因此，及时给予患者营养支持对于促进患者预后及延长患者生存期具有重要意义。

中医理论认为PVS患者多为患者久病多虚，脏腑功能衰退，气血津液不足，而导致脑充氧失常，故在醒脑开窍的同时扶正补虚，以标本兼治。《灵枢·邪客》曰：“营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血以荣四末，内注五脏六腑……”，故脾胃为气血生化之源。同时，由于痰、瘀和毒邪阻蔽清窍，气血难以上输于脑窍，使脑中气血不足。气血是生命运动的物质基础和先决条件，故治疗应从脾胃功能为切入点，调节从肠道菌群的治法理论可行。有研究报道，实施肠内营养支持的PVS患者，极大地改善了营养状况，且显著降低了并发症发生率，提高了生存率[19]。也有研究显示，通过2周肠内营养支持，PVS患者的营养学指标，包括血糖、血清总蛋白等较治疗前均有显著改善[20]。本研究结果显示，治疗后两组血清白蛋白、前白蛋白及血红蛋白水平与本组治疗前比较均显著增高，且试验组上述血清营养指标显著高于对照组。

有研究显示，应用NRS2002能筛查出存在营养风险的患者，给予有营养风险的患者营养支持后，可改善临床结局，如缩短住院时间、降低并发症发生率和减少再次入院次数等[21]。本研究显示，治疗前两组NRS2002评分均>3分，说明两组患者均存在营养风险。治疗后试验组与对照组NRS2002评分与本组治疗前比较均降低，但试验组降低更为显著。随访第30天、90天时，两组NRS2002评分与本组治疗前比较均显著降低，且试验组显著低于对照组，表明采用针刺水沟穴联合肠内营养治疗能显著改善PVS患者营养状况。

近年来，关于脑与肠两者之间存在双向调节关系的大量临床研究集中在促醒，本研究基于脾胃理论，从中医学脾的功能来理解肠道菌群的调节作用，重视气血生化之源，调节肠道微生物，进而对患者的营养状态起到正向的调节作用，本研究方法操作简单，可复制性强，容易控制变量，为临床制定针刺治疗方案提供一定的参考价值。

但本试验同时存在一些遗憾，主要是未能引入脑功能观察及评价指标，如比较基于静息态功能磁共振(resting-state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI)技术的比率低频振幅(fractional amplitude of low frequency fluctuation，fALFF)、局部一致性(Regional homogeneity，ReHo)、脑灰质和白质体积，以分析两种治疗方法治疗前后的脑功能差异、试验前后血清脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)测定以及PVS量表/昏迷恢复量表-修订版(Coma recovery scale-revised，CRS-R)的比较等。因此，下一步将开展相关研究，引入以上观察及评价指标，进一步探讨和阐释针刺水沟穴是否可以通过“微生物-肠-脑”改善PVS患者的脑功能及意识状态，进一步为PVS患者促醒治疗提供有效的治疗方案。