中草药对花鲈肝细胞氧化损伤的保护作用

王秀琴，张春晓，鲁康乐，王 玲，宋 凯

(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

花鲈(Lateolabraxmaculatus)，别名海鲈、七星鲈。因其具有适应性广、肉鲜味美、营养丰富与生长快速等优质特性，深受养殖户喜爱，年产量逐年增长，2018年其养殖产量高达16.66万吨[1]，成为仅次于大黄鱼的第二大海水养殖鱼类。然而，高密度的养殖模式以及化学药剂的滥用会引起鱼类机体的氧化应激，进而破坏肝功能，导致肝脏损伤，影响鱼类正常生长[2-5]。因此有必要防止氧化应激对鱼类造成的影响。基于此，近些年科研工作者致力于开发一种“绿色、高效、低成本”的保肝型绿色添加剂来应对氧化应激。中草药具有低成本、污染少、毒副作用小等优点，其主要发挥作用的成分如多糖、类黄酮和皂苷类能减少氧化应激，保护肝脏[6]。在我国，使用中草药预防和治疗鱼类疾病已十分普遍[7-8]。因此，本实验以原代培养花鲈肝细胞为实验材料，拟从具有保肝功能的10种单方和10种复方中[9]筛选出能有效缓解原代培养花鲈肝细胞氧化损伤的中草药，为中草药在花鲈养殖业更广泛的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

花鲈购于福建省漳州市诏安县慧丰水产发展有限公司。将实验鱼放置在1×103L的循环桶中暂养，每天饱食投喂一次(9:00)，并换50%体积的淡水，水温维持在27 ℃左右，溶解氧大于7.5 mg/L，pH 5.9～6.8。实验鱼适应性饲养两周后，每次实验前挑选体格健壮、规格一致的花鲈(体重(30±5.0)g，体长(10±0.9)cm)，放入盛有体积分数为0.1%的青霉素与链霉素的水里暂养并禁食12 h。

1.2 主要试剂

于厦门集美印斗路莲福堂大药房购买实验所需的中草药。

胰蛋白酶(体积分数0.25%)、L-15培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。总蛋白定量(BCA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、10 000 IU/mL青霉素(S)和10 000 IU/mL链霉素(P)购自北京索莱宝科技有限公司。过氧化氢(含过氧化氢30%)、红细胞裂解液、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)购自南京建成生物工程研究所。

完全培养基：L-15培养基(含有1%S/P，15%FBS(体积分数))。

1.3 花鲈原代肝细胞的培养

花鲈原代肝细胞培养方法参照李磊等[10]的报道。

1.4 中草药的制备

将10味单方中草药(甘草、银杏、柴胡、丹参、苍穹、赤芍、五味子、大黄、姜黄和猪苓)直接粉碎，10味复方中草药(主要成分见表1)按照一定比例粉碎混合，各方称取20 g倒入盛有150 mL 纯水的玻璃杯中，浸泡1 h后，开始煎煮，温度保持在90 ℃，边煮边搅拌。待煮0.5 h后过滤，收集滤液，重复煎煮并收集滤液3次。合并3次滤液，浓缩定量至20 mL，使各方中草药质量浓度为1 g/mL，经离心灭菌处理后，暂存于4 ℃冰箱。

1.5 中草药安全性评价

将原代培养的花鲈肝细胞平铺于96孔板中，培养24 h贴壁后，再分别加入20味中草药(质量浓度为5 mg/mL)孵育4 h，然后使用CCK-8检测肝细胞的存活率。实验重复5次。

表1 复方中草药部分组成成分表

1.6 实验分组设计

H2O2诱导肝细胞氧化损伤的方法参照张润蔚[11]的实验并稍作修改，按其方法获得的适宜损伤条件为：H2O2浓度为200 μmol/L，作用时间为2 h。花鲈肝细胞培养24 h后，将其分为对照组、损伤组、药物组。对照组换用新的完全培养基孵育肝细胞6 h后收集培养液与肝细胞；损伤组先用完全培养基孵育肝细胞4 h后，再换用200 μmol/L H2O2的新培养基孵育肝细胞2 h，收集培养液与肝细胞；药物组用含质量浓度为5 mg/mL的中草药完全培养基孵育肝细胞4 h，再换用200 μmol/L H2O2继续孵育肝细胞2 h后收集培养液与肝细胞。

1.7 生化指标的测定

生化指标测定按试剂盒说明书进行。

1.8 数据处理

所用实验数据经Excel处理后用SPSS 20.0分析软件进行单因素方差分析(one-Way ANOVA)，多重比较方法选用Tukey法，以P<0.05表示差异显著，实验数据最终以均值±标准误(Mean±SE)的形式表示。

2 结果与分析

2.1 中草药对花鲈肝细胞活力的影响

由图1～2可知：与对照组相比，10种单方和10组复方中草药对花鲈肝细胞的存活率无显著影响(P>0.05)。所以，本实验所用的20组中草药均对花鲈原代肝细胞无毒副作用。

2.2 各组AST、ALT和LDH活性的变化

由表2可知：损伤组培养液中AST、ALT和LDH较对照组显著升高(P<0.05)，除大黄组以外的其他单方组的AST、ALT和LDH活性较损伤组显著降低(P<0.05)；姜黄、甘草和五味子单方组的AST活性较其他单方组显著降低(P<0.05)；姜黄、丹参和五味子单方组的ALT活性较其他单方组低(P<0.05)；姜黄单方组的LDH活性水平较其他单方组低(P<0.05)。综上，除大黄以外的其他9种单方均能保护肝细胞氧化损伤，其中姜黄组的保护效果最佳。

由表2还可知：H2O2损伤组，AST和ALT活性显著高于对照组(P<0.05)；LDH活性有上升趋势，但无显著影响(P>0.05)。M5组的LDH较损伤组无显著差异(P>0.05)；10种复方组的AST和ALT活性与损伤组比显著降低(P<0.05)；M9组的AST、ALT和LDH活性较其他各复方组低(P<0.05)，其AST和ALT的活性与对照组无差异(P>0.05)。综上，除M5组以外的其他9组复方中草药均能缓解肝细胞氧化损伤，以M9复方保护效果最佳。

表2 各组花鲈肝细胞AST、ALT和LDH活性

2.3 各组T-AOC、SOD和MDA水平的变化

如表3所示，在H2O2处理肝细胞2 h后，损伤组的T-AOC和SOD活性较对照组显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05);姜黄、甘草、大黄、丹参和银杏单方组的T-AOC活性较损伤组显著升高(P<0.05);10味单方组的SOD活性较损伤组均显著升高(P<0.05)；柴胡和苍穹单方组肝细胞中MDA含量与损伤组相比没有显著差异(P>0.05),姜黄单方组肝细胞中T-AOC和SOD活性则高于损伤组。综合以上结果，在本实验条件下，与其他单方组相比，姜黄单方组对氧化损伤的花鲈肝细胞的保护效果最好。

由表3可知，M10组的T-AOC活性与损伤组相比无显著差异(P>0.05)，M7和M10组的SOD活性与损伤组相比无显著差异(P>0.05)，M2、M3、M8和M10组的MDA含量与损伤组相比无显著变化(P>0.05)；M1、M4、M5、M6、M9组的T-AOC和SOD活性显著高于损伤组(P<0.05)，MDA含量显著低于损伤组(P<0.05)。M9组T-AOC和SOD活性高于其他各复方组，而MDA含量低于其他各复方组，即M9组对H2O2诱导的花鲈肝细胞氧化抗损伤作用最强。

表3 各组花鲈肝细胞T-AOC、SOD和MDA的含量

3 讨论

H2O2是一种作用很强的氧化剂，其通过氧化细胞膜，使细胞膜组分发生异常，胞内AST、ALT释放到体液中，引起细胞或组织氧化损伤[11-15]。本实验中，用H2O2直接处理肝细胞后其培养液中AST、ALT和LDH的活性水平上升，说明肝细胞发生氧化损伤。而在H2O2处理前使用中草药加以保护，AST、ALT和LDH的活性均降低，这说明中草药能缓解H2O2引起的肝细胞氧化损伤。姜黄和五味子单方组的AST、ALT和LDH的含量低于其他组，说明这两味中草药能显著提高肝细胞的抗氧化能力。有研究表明，中草药中含有的多糖类、类黄酮和皂苷类，能保护肝脏免受氧化损伤[16]，姜黄含有丰富的酚类化合物，可减少细胞内ROS生成[17-19]。王丽宏等[20]的研究表明五味子的有效成份木脂素类，通过降低转氨酶活性，维持肝脏的正常生理状态。综上，姜黄和五味子中的有效成分具有清除自由基、降低转氨酶活性和提高机体抗氧化的能力。

有研究[21]表明，有些中草药配伍，能更大程度地发挥作用。本实验中M9组显著降低AST、ALT和LDH的活性，可能是因为此复方中的中药具有协同保护肝脏的作用。赤芍因其含有丰富的单萜苷类化合物，可以通过抑制ROS的产生，提高抗氧化能力[22]，与金钱草配伍，可以降低肝脏中转氨酶的活性，清除自由基，保护肝脏免受损伤[23]。

T-AOC反映机体总抗氧化的能力。本研究中，损伤组T-AOC的活性较对照组低，表明肝细胞抗氧化能力下降。姜黄单方组和M9组T-AOC的活性明显高于其他各组，说明这两方中草药提高了肝细胞的抗氧化能力，保护肝细胞免受H2O2的不利影响，维持肝脏的健康。MDA是脂质过氧化的重要产物，是判断细胞或组织发生氧化反应的重要指标之一[24]。SOD通过清除细胞或组织内的自由基来保护机体免受损伤，其活性的大小反映机体抗氧化能力的强弱[25]。姜黄组和M9组SOD的活性较损伤组显著升高，同时脂质过氧化产物MDA的含量显著下降，这说明这两方中草药肝细胞清除自由基能力变强，可以减少H2O2引起的氧化损伤。有研究[26]表明，姜黄素可以通过升高T-AOC和SOD活性水平,减少MDA生成，来对抗氧化应激，这与本实验结果一致。孙学亮等[21]的研究表明，由大黄、丹皮和黄芪为主要成分组成的复方中草药通过提高亚东鲑(Salmotruttafario)和白点鲑(SalvelinuspluviusHilgendorf)血液中SOD和T-AOC的活性，提高其抗氧化能力，是因为其之间的协同作用。由此可知，姜黄单方和M9复方对H2O2诱导的花鲈原代肝组织损伤的保护作用与其清除自由基能力有关。姜黄能保持细胞抗氧化指标(T-AOC和SOD)的酶活性，使MDA的生成减少，增强抗氧化能力。

4 结论

在本研究的10味单方和10味复方中草药中，丹参、银杏、姜黄、甘草、赤芍、猪苓、五味子单方组，M1、M4、M6、M7、M9复方组均能缓解由H2O2诱导的原代培养花鲈肝细胞损伤，提高肝细胞的抗氧化能力；大黄、柴胡、苍穹单方组，M2、M3、M5、M8、M10复方组的抗氧化能力较其他组弱。从20组中草药中筛选出姜黄单方和M9复方对肝脏保护效果最好。