GSDMD介导的细胞焦亡在眼科疾病中的研究进展△

刘可欣 李志坚 刘翔宇

Gasdermin是最近发现的一个具有成孔效应的蛋白家族，其能造成细胞膜通透性改变与细胞焦亡[1-2]。目前该家族在人体中包含6个旁系同源基因：gasdermin A(GSDMA)、gasdermin B(GSDMB)、gasdermin C(GSDMC)、gasdermin D(GSDMD)、gasdermin E(GSDME)(也称为DFNA5)和PJVK(也称为DFNB59)。直到2015年，几项独立研究[1,3-4]揭示了gasdermin的功能机制，确定GSDMD是焦亡的最终执行者。通过在人类基因组数据库中搜索GSDMA的同源物，GSDMD(也称为GSDMDC1、DFNA5L或FKSG10)首次被鉴定出来[5]，

其在不同的人类组织以及白细胞的不同亚群中广泛表达[6-7]，GSDMD直系同源基因仅存在于哺乳动物基因组中。作为焦亡最终执行蛋白，GSDMD是近几年的研究热点，对于其结构、功能及抑制剂均有大量报道。但目前涉及GSDMD的眼部相关疾病的研究较少，对GSDMD以及其相关的眼科疾病的进一步研究可为眼科相关疾病诊疗提供新思路。

1 焦亡的发生发展及机制

1992年，Zychlinsky等[8]观察到由弗氏志贺菌诱导宿主巨噬细胞发生的程序性细胞死亡，最初被认定为细胞凋亡。进一步研究表明，这是一种依赖caspase-1的新型细胞死亡形式，称为焦亡[9]，与凋亡以形态上的不同进行区分。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡，其主要特征为炎症小体形成、促炎半胱氨酸蛋白酶和gasdermin激活、大量促炎因子和细胞内含物释放。其中，caspase-1和鼠源caspase-11(人源caspase-4/-5)可对GSDMD特异性切割，进而激活其成孔活性，导致细胞丧失质膜完整性。焦亡细胞的细胞膜失去了调控物质进出的能力并迅速膨胀，最终导致细胞发生渗透性崩解，同时释放出大量细胞内含物如炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-18和高迁移率族蛋白 1(HMGB-1)到细胞外环境，引发炎症反应。

焦亡通路包括主要依赖caspase-1的经典通路和主要依赖caspase-4/-5/-11的非经典通路。在经典焦亡通路中，细胞质内模式识别受体(PRRs)能识别病原体相关分子模式(PAMPs)、内源性危险相关分子模式(DAMPs)。当PRRs产生信号后，炎症小体复合物开始组装，经典炎症小体由辅助蛋白和自身寡聚化支架蛋白组成，通常属于核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族。被炎症小体激活的caspase-1对GSDMD进行切割，并对IL-1β和IL-18等炎症因子的前体进行加工修饰，促进炎症因子成熟、分泌，诱导细胞焦亡。在非经典焦亡通路中，胞内脂多糖结合caspase-4/-5/-11并诱导这些caspase活化，使其切割GSDMD[10-11]。被切割的GSDMD在质膜上形成孔隙，GSDMD孔引起钾离子释放导致NLRP3的活化和IL-1β、IL-18的成熟，而后成熟细胞因子经GSDMD孔释放。然而，Huang等[12]在近期一项研究中指出，脂多糖在内皮细胞中并不引起细胞死亡，而是抑制细胞增生。但无论是哪种焦亡通路，GSDMD蛋白均为诱导细胞焦亡的最终执行者[1,3,13]。

近来研究表明，一直以来被认为是参与细胞凋亡的caspase-8亦可通过裂解GSDMD导致细胞焦亡，并伴有IL-1β释放[14-17]。体外研究表明，GSDMD是非经典炎症通路下游细胞死亡的唯一执行者。然而，值得注意的是，由于凋亡相关的斑点样蛋白病灶或caspase-1更混杂的蛋白水解活性可能会刺激备用细胞死亡程序，因此在经典炎症小体激活后，GSDMD的缺失并不能完全阻止细胞死亡[1,3-4]。

2 GSDMD的活性孔隙形成及其与焦亡的关系

焦亡的特征在于gasdermin孔隙形成，进而导致细胞膜破裂。GSDMD的中央连接区(人源FLTD及鼠源LLSD)被caspase切割，产生具有成孔活性的相对分子质量为31 000的N末端结构域(GSDMD-NT)，以及对前者具有抑制作用的相对分子质量为22 000的C末端结构域(GSDMD-NT)两个片段[1-4,14,18-19]。当两者之间的连接蛋白水解、GSDMD的分子内抑制作用解除后，GSDMD-NT插入细胞膜形成寡聚孔，从而破坏细胞的离子稳态并诱导细胞焦亡。

由于各gasdermin家族中各成员的N末端结构域序列具有高度相似性，据此可以推测出大多数gasdermin的成孔机制相似。研究人员根据全长GSDMA3的高分辨率晶体结构和从重组脂质体中提取的GSDMA3-NT孔洞的低温电镜结构预测了GSDMD的结构，揭示了上述的自抑制现象[2,20]。而后Liu等[21]首次报道了人源和鼠源GSDMD蛋白的全长晶体结构，阐述了GSDMD-NT的抑制状态以及gasdermin蛋白家族自抑制机制的异同，揭示了重叠界面参与GSDMD的自抑制、脂质结合、寡聚以及其对诱导细胞焦亡的重要性。

Gasdermin的N末端在体外可以直接与膜脂相互作用。其中，GSDMD-NT优先靶向酸性磷脂，例如磷酸肌醇和心磷脂，但也可与磷脂酸和磷脂酰丝氨酸弱结合[2,19]。磷酸肌醇仅存在于细胞膜的胞质小叶中，所以GSDMD-NT只从胞质面形成孔隙，在细胞外加入活化的GSDMD并不会造成细胞膜的裂解[2]，因此相邻细胞可免受焦亡细胞中GSDMD的损伤[19]。心磷脂具有类似于磷酸肌醇带负电荷的头部结构，其存在于真核生物线粒体内膜和细菌膜中。已有研究表明，GSDMA3-NT和GSDMD-NT单独或不受分子内抑制时可以破坏线粒体[22-23]，并且当细菌暴露于重组GSDMD-NT时，细菌的生成会受到抑制[19]，不过GSDMD-NT进入内膜的机制还有待进一步研究。Gasdermin孔的直径为10～15 nm[2,19,24]，可使IL-1β(4.5 nm)[2,19]和IL-18(5.0 nm)通过，直径25～30 nm的核糖体和较大的细胞器则不会通过孔隙[25]。内体分拣转运复合体(ESCRT)系统在GSDMD引起焦亡过程中可发挥修复膜孔的作用，减少焦亡和IL-1β等细胞内容物的释放[26-27]。

3 GSDMD眼部相关疾病的研究

自从焦亡领域受到广泛关注后，众多学者针对眼科疾病中NLRP3、caspase-1/-4/-5/-11、IL-1β、IL-18等成分的表达作出了大量研究，从而证明焦亡与多种眼科疾病发病机制相关，为靶向眼科疾病治疗提供了思路。然而，因GSDMD被发现较晚，与其相关的眼科疾病研究还处于起步阶段，接下来对近几年与GSDMD相关的眼科疾病研究进行介绍。

3.1 干眼症干眼症是一种常见的多因素诱导的自身免疫性眼表疾病。Chen等[28]研究证实了GSDMD依赖性焦亡在干燥应力和高渗透压等环境因素影响下诱发干眼症中的关键作用。NLRP12和NLRC4炎症小体由Toll样受体4诱导的caspase-8激活，诱导GSDMD裂解和IL-33成熟，协同启动干眼症发展过程中黏膜上皮细胞的焦亡。这种信号可以通过IL-33放大，从而触发干眼症的炎症级联反应，而IL-33的加工和炎症级联反应需要GSDMD的参与。抑制NLRP12或NLRC4、GSDMD基因缺失以及中和成熟IL-33的作用可以显著减轻干燥应力引起的角膜上皮损伤，这表明上述成分是治疗干眼症的潜在靶点。

3.2 角膜病Niu等[29]探讨了NLRP3炎症小体介导的焦亡在PM2.5相关角膜毒性中的作用。研究结果显示，在PM2.5处理的细胞中，角膜上皮细胞活性呈剂量依赖性下降。其中，由NLRP3炎症小体介导、涉及NLRP3、凋亡相关的斑点样蛋白、GSDMD、caspase-1、IL-1β和IL-18的焦亡通路被激活，并且上述物质及活性氧(ROS)在实验组小鼠角膜上皮细胞中的表达与对照组相比均显著增加。进一步的体内研究证实了该通路在暴露于PM2.5的小鼠角膜中被激活。

3.3 白内障白内障是最常见的致盲性眼科疾病。已知基因CRTAC1异常表达通过影响细胞凋亡参与白内障的形成，Sun等[30]对CRTAC1在焦亡过程中的调节作用以及其在紫外线(UVB)诱导的细胞损伤模型中的潜在作用机制进行了研究。结果表明，焦亡标志物(NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18)水平在白内障患者晶状体囊膜组织或细胞中均显著增高。UVB照射可明显诱导上述焦亡标志物在人晶状体上皮细胞(HLECs)中的表达，而CRTAC1下调可减少UVB诱导产生的ROS含量和焦亡，这提示CRTAC1可能介导白内障形成中的细胞焦亡。ROS抑制剂N-acetyl-L-cysteine可阻断CRTAC1过度表达引起的焦亡作用，这提示CRTAC1介导的、UVB诱导的HLECs焦亡可通过ROS/NLRP3/caspase-1信号通路发生，证实了其在白内障形成中的作用。

Wang等[31]对短波长蓝光暴露后白内障的发病机制进行了研究。结果证明，经短波长蓝光照射后的SD大鼠晶状体的透明度变差，且晶状体上皮细胞中caspase-1、caspase-11和GSDMD的表达水平显著高于对照组。在HLECs中，短波长蓝光照射组的细胞与对照组相比数目减少，形态上出现肿胀，且经流式细胞术检测后发现短波长蓝光照射组的碘化丙啶和Annexin V染色双阳性HLECs比例与加入caspase-1抑制剂组相比显著增加。说明细胞焦亡在短波长蓝光诱导的大鼠白内障的形成中起关键作用。

3.4 青光眼/高眼压症青光眼是一种多因素视神经病变，其特征在于视网膜神经节细胞(RGCs)的结构改变和不可逆的视力丧失，高眼压(OHT)是青光眼的高风险因素。在急性OHT损伤后，RGCs的凋亡、自噬和坏死已经得到了深入研究，焦亡却很少有相关报道。

Chen等[32]利用小鼠视网膜缺血-再灌注(RIR)模型和体外糖氧剥夺/复氧(OGDR)模型，探讨急性青光眼的发病机制。研究结果揭示了一个与青光眼视力丧失相关的小胶质细胞诱导、焦亡介导的RGCs死亡的新机制。GSDMD基因缺失可显著改善急性青光眼患者RGCs死亡和视网膜组织损伤。此外，小胶质细胞的GSDMD裂解依赖于caspase-8-缺氧诱导因子1α(HIF-1α)信号转导。NLRP12、NLRP3、NLRC4在caspase-8-HIF-1α轴下游协同作用，通过caspase-1激活来诱发焦亡和IL-1β成熟，而IL-1β的加工反过来又放大了caspase-8-HIF-1α-NLRP12/NLRP3/NLRC4焦亡通路，从而加速炎症级联反应。

Pronin等[33]在OHT损伤的RGCs、视网膜星形胶质细胞以及放射状胶质细胞(Müller细胞)中检测到包含NLRP1、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)炎症小体复合物的急性激活，并检测到了caspase-1的活化和成熟IL-1β的释放，这与RGCs层和内核层的神经元以及胶质细胞中GSDMD的表现一致。在 caspase-1/-4/-11基因缺失、Panx1基因缺失的视网膜中，以及用Panx1抑制剂丙磺舒处理的野生型小鼠中，OHT诱导的细胞因子释放和RGCs死亡均显著降低。这些结果表明GSDMD依赖的焦亡通路对OHT损伤细胞的病理生理学有重要作用。

3.5 年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种破坏性眼病，且治疗方法有限。视网膜色素上皮(RPE)细胞是受AMD影响的主要细胞类型，其在疾病晚期会经历程序性细胞死亡。

Gao等[34]对炎症小体活性与大鼠内RPE细胞死亡机制的相关性进行了研究。Long-Evans大鼠接受玻璃体内注射β淀粉样蛋白(Aβ)。处死大鼠后收集玻璃体标本并检测其细胞因子分泌水平，结果显示caspase-1免疫反应性、核转录因子-κB(NF-κB)核移位、IL-1β及IL-18蛋白水平明显增加。在RPE-脉络膜组织中，caspase-3和GSDMD的蛋白水解水平升高。形态学分析显示包括RPE细胞肿胀在内的焦亡特征。上述结果提示RPE细胞经过Aβ诱导的长时间炎症激活后，焦亡和凋亡这两种细胞死亡途径均被激活。

Yang等[35]用体外AMD模型研究了Aβ1-40是否会引起ARPE-19细胞焦亡，并评价了枸杞多糖对Aβ1-40寡聚体诱导的ARPE-19损伤的影响。结果显示，Aβ1-40寡聚体显著降低了ARPE-19细胞的活力，细胞在形态上有明显的肿胀、细胞膜破裂等焦亡改变，且伴有IL-1β和IL-18表达增加。此外，Aβ1-40寡聚物能够上调包括NLRP3、caspase-1和GSDMD-NT在内的焦亡标志物的细胞免疫反应性。枸杞多糖则可以改善ARPE-19细胞活性及形态，并且破坏Aβ1-40寡聚。

Kerur等[36]发现在人类细胞培养和小鼠模型中，RPE细胞变性由caspase-4/-11和caspase-1介导的非经典焦亡通路所驱动，并且需要环状GMP-AMP合成酶依赖的干扰素-β的产生和GSDMD依赖的IL-18的分泌，AMD晚期患者的RPE细胞中可见caspase-4、GSDMD、干扰素-β和环状GMP-AMP合成酶水平升高。

3.6 糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的标志性并发症之一，也是导致成人视力下降的主要原因。视网膜周细胞死亡是DR发病的一个显著特征。

Gan等[37]首次揭示了高糖通过NLRP3-caspase-1-GSDMD介导焦亡诱导视网膜周细胞损伤。高糖诱导NLRP3-caspase-1-GSDMD通路激活和孔隙形成，呈剂量和时间依赖性，并且导致人视网膜周细胞中IL-1β、IL-18和乳酸脱氢酶的释放。GSDMD的过度表达促进高糖诱导的焦亡。GSDMD基因沉寂以及应用caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK后，焦亡效应被减弱。

高糖可通过引起氧化应激从而诱导RPE细胞死亡。Xi等[38]用不同浓度的葡萄糖处理ARPE-19细胞，发现高糖(50 mmol·L-1)可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和ROS的产生，且ARPE-19细胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达水平均升高，提示高糖可导致细胞焦亡。应用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和焦亡抑制剂Necrosulfonamide(NSA)使高糖(50 mmol·L-1)对ARPE-19细胞增殖、凋亡和焦亡的影响发生逆转，这些研究结果为DR的发病机制的研究提供了新思路。

3.7 视网膜脱离Li等[39]对GSDMD在大鼠视网膜脱离(RD)所致光感受器细胞焦亡中的作用进行了研究。结果表明，大鼠RD后第1天，GSDMD裂解达到高峰。raav2/8-GSDMD-C干预后，大鼠RD后光感受器细胞内IL-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达降低，焦亡和凋亡程度减轻，视网膜内的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、F4/80和离子钙接头蛋白分子-1(IBA-1)的激活减缓，视网膜功能得到保护。由此可见，GSDMD参与大鼠RD后光感受器细胞的焦亡，GSDMD-C过度表达可阻断GSDMD的裂解，抑制光感受器细胞变性。

4 展望

焦亡作为近年来的研究热点受到广泛关注，对于GSDMD的眼科疾病发病机制以及抑制剂的相关研究为许多病因不明的眼科疾病诊治提供了新的研究思路。尽管GSDMD在眼科疾病研究中仍处于起步阶段，在疾病进程中焦亡通路与其他通路之间是否存在协同、交叉等作用尚未完全清楚，但GSDMD作为一个新兴的治疗靶点，具有极大的研究潜力，其在眼科疾病研究中的前景值得期待。