角膜内皮细胞治疗研究进展△

胡芷馨 肖宇婷 刘 欣 张明昌

角膜的透明度是由角膜内皮通过泵和屏障功能维持的[1]。然而，人角膜内皮细胞(HCECs)的再生能力非常有限[2]，HCECs的损伤代偿机制通常通过损伤区域周边细胞的移行和扩大来补充并覆盖受损伤区域，最终导致HCECs密度降低，当HCECs密度下降到临界水平(通常低于500～1000个·mm-2)时，细胞数量不足以代偿性脱水，角膜就会因为基质中过多的房水储存而变得混浊[3]。这种角膜内皮失代偿会导致严重的视力损害，目前唯一有效的治疗选择是使用供体角膜进行角膜移植[4]。

随着手术技术的创新，目前已经进入了成分角膜移植的时代，成分角膜移植极大地提高了角膜移植的利用率[5]，但仍然面临着角膜供体缺乏这一关键问题[6]。此外，同种异体移植仍然面临着长期免疫排斥风险，因此开发其他的替代治疗方案尤为迫切[7]。最近，有研究人员发现，HCECs可在体外扩增，在体内有再生潜力[8-9]，并且人角膜是细胞治疗的理想器官——具有免疫赦免及无血管的器官特性，移植细胞比其他含血管器官的免疫耐受性更好。随着对角膜内皮认识的深入，研究人员目前正在探索角膜内皮细胞的治疗方案，有

望避免传统角膜移植存在的局限性[10]。本文主要对角膜内皮细胞治疗方面的最新研究进展进行综述，以期对读者有所启迪。

1 HCECs的扩增和再生

1.1 HCECs体外扩增由于接触抑制和转化生长因子(TGF)-β使HCECs阻滞在G1期[11]，学者们以前认为HCECs不具备细胞分裂能力。1979年，Baum等[8]首次报道在适当的环境下，HCECs可发生有丝分裂。此后，研究者们开发了培养HCECs的各种方案、培养基和添加剂[12]。然而，培养过程仍面临困难，研究人员一直致力于研究提高HCECs的增殖能力，抑制内皮间充质转化的方案[13]。

在HCECs培养中添加ROCK抑制剂是近十年来HCECs培养的主要进展之一[14]。ROCK蛋白在细胞骨架的调节中起着决定性的作用，它通过调节肌动蛋白的组织，进而调节细胞的迁移和黏附。在动物模型中也发现了类似的效应[15]。分子机制包括促进p27的降解以刺激细胞增殖以及通过PI3-激酶信号途径表达细胞周期蛋白D促进细胞增殖[16]。最近有研究发现，H-1152在体外对细胞迁移和增殖的刺激作用优于Y-27632[17]，p38MAPK抑制剂SB203580促进了HCECs的增殖，并与维持细胞密度和功能特性有关[18]。

抑制内皮间充质转化保持角膜内皮细胞的功能也很重要，成纤维细胞改变是由TGF-β信号的激活引起的，伴随着泵和屏障功能的丧失[19]。在培养基中添加转化生长因子信号转导抑制剂，如SB431542，可以抑制成纤维细胞的改变。然而，使用其他培养技术，如条件培养基、p38MAPK抑制剂和层粘连蛋白E8片段，也具有抑制成纤维细胞改变的能力，这些都表明，细胞在培养过程中出现的成纤维细胞改变涉及多个因素[20]。

目前，有多种方案用于培养HCECs，确定一套标准的最优培养技术并将其应用于临床是迫在眉睫的。

1.2 角膜内皮细胞其他替代来源除了培养原代角膜内皮细胞外，一些研究人员对角膜内皮细胞的其他替代来源进行了研究。有研究发现，诱导与角膜内皮细胞相关的成体细胞分化可以获得角膜内皮细胞，如成人皮肤来源的前体细胞与角膜内皮细胞有着相同的神经嵴细胞来源，表现出与神经嵴干细胞相似的特征，研究人员已经成功地从成人皮肤来源的前体细胞分化出角膜内皮样细胞，这些细胞在不同的大泡性角膜病变动物模型中进一步证明了它的治疗作用[21]。此外，多能干细胞可能来自成体成纤维细胞，通过诱导这些多能干细胞分化为神经嵴细胞，最后分化为角膜内皮细胞[22]。但是，这些细胞来源仍处在实验阶段，若以后想将其用于细胞治疗，培养方案还需进一步优化。

如果自体前体细胞产生角膜内皮细胞这项技术成熟，并能够用于治疗角膜内皮功能障碍患者，既可降低对供体组织的需求，又可降低同种异体移植以后的排斥反应风险，在角膜内皮功能障碍的治疗中具有极大的应用前景和优点。然而，其他干细胞来源缺乏可靠的方案来产生角膜内皮细胞，在进一步用于人类之前，需要解决其有效性、稳定性、治疗效果以及伦理问题。

1.3 角膜内皮干细胞体内再生1982年，Raviola[23]首次在猴子身上发现了沿Schwalbe线具有不寻常超微结构特征的环状不连续细胞线，随后的解剖学研究确定了从内皮和Schwalbe线外围到小梁网前部的过渡区的祖细胞群体，称为后缘，它们既能产生内皮细胞，又能产生小梁细胞[9]。此外，Bednarz等[24]证实了HCECs从后缘再生，提示只在周边的HCECs具有有丝分裂活性，而不是来自中央角膜的HCECs。后缘角膜干细胞标志物(如巢蛋白、LGR5和碱性磷酸酶等)的发现表明，这些细胞可能具有再生能力[25]。

采用球体培养法在体外分离培养角膜内皮干细胞同样也有研究报道，荧光示踪器(CM-DIL)用于验证细胞的克隆形成状态。DIL标记的细胞被放置在球体上进行培养。获得的细胞培养物根据其DIL阳性(再生潜力)或DIL阴性(无再生潜力)状态来区分。溴脱氧尿嘧啶核苷标记证实了DIL阳性角膜内皮细胞的再生能力，然后再培养分离的细胞，通过球体培养法培养的角膜内皮细胞比普通体外培养形态更好[26]。

最近，有学者提出了剥离后弹力层术(仅后弹力层剥离而不进行角膜内皮移植)来治疗Fuchs角膜营养不良[27-29]，结果表明，角膜内皮可在体内再生。然而，去除后弹力层在临床上的结果有好有坏，仍存在争议。此外，体外培养的角膜内皮细胞最终要移植到体内，只有进一步了解角膜内皮细胞在体内转归的情况，才能更好地利用培养的角膜内皮细胞并将之应用于临床。对于角膜内皮干细胞及其在体内再生的机制还需深入探索。

2 角膜内皮细胞的移植

2.1 组织工程学内皮植片生物工程角膜内皮植片移植避免了供体角膜短缺的问题。然而，移植生物工程植片的过程类似于后弹力层剥除自动角膜内皮移植术或后弹力层角膜内皮移植术，所以和角膜移植术有相同的困难，包括处理薄、易碎的植片，机械损伤导致细胞丢失以及植片从宿主基质中脱落的风险。

替代供体角膜基质的生物工程选择包括生物材料，如羊膜，以及合成替代品，如胶原基生物墨水、聚醋酸乙烯酯和胶原复合物、明胶和聚己内酯复合物以及甲基丙烯酸酯明胶水凝胶[30]。理想的材料应该是具有足够的机械强度和光学透明性，且具有生物相容性的材料，以支持角膜基质细胞的生长和代谢。有研究表明，层状的、携带角质细胞的超薄羊膜作为角膜基质替代材料取得了良好的效果[31]，为基础研究和治疗潜力开辟了新的途径。

合成聚合物具有纯度高的优点，其化学组成、结构、物理性能和降解时间是已知的。然而，某些成分可能会引起炎症反应[32]。生物介质脱细胞猪角膜基质(如后弹力层)是角膜内皮细胞的天然底物。我们课题组通过临床试验证明了在板层角膜移植术中，脱细胞猪角膜基质材料在治疗角膜真菌性溃疡的安全性和有效性[33]。脱细胞猪角膜基质可以保留天然的后弹力层结构，使得它具有极佳的应用潜能。

2.2 细胞注射另一种方法是在没有载体的情况下以细胞悬液的形式注射细胞。然而，由于房水流动，细胞附着到角膜内皮面是一直以来存在的难题，研究人员提出了不同的方法来促进角膜内皮细胞的附着。Mimura等[34]使用铁粉来控制细胞黏附，并展示了通过使用钕磁铁的磁导，使得兔角膜内皮细胞内含球形铁粉，以帮助修复兔模型的角膜内皮。同样，在体外人眼前段模型中，将超顺磁性微球加入到HCECs可改善磁引导后的细胞附着[35]，内含生物相容的超顺磁性纳米颗粒的HCECs在其活性和细胞功能特性方面没有变化[36]。此外，一项兔模型的临床前研究表明，将含有生物相容性纳米颗粒的HCECs注入前房，可以修复角膜内皮，而且没有明显不良影响[37]。另一种调节细胞黏附的方法是使用ROCK抑制剂[38]。研究表明，移植的角膜内皮细胞受到底物黏附限制的影响，这个过程解离诱导Rho/ROCK/MLC信号激活，导致细胞黏附功能受损。ROCK抑制剂通过对抗解离诱导的这一信号通路的激活来增强细胞黏附[39]。在兔模型中，注射含有ROCK抑制剂的兔角膜内皮细胞后，角膜内皮再生并恢复透明，而注射不含ROCK抑制剂的兔角膜内皮细胞则不能恢复透明[38]。一项使用灵长类动物模型的临床前研究还表明，在灵长类角膜内皮功能障碍模型中，注射含有ROCK抑制剂的灵长类角膜内皮细胞或HCECs，角膜内皮可以再生[39]。

2013年，日本有学者进行了基于细胞治疗的首个人体临床试验(临床试验注册编号：UMIN000012534)[40]，临床数据显示，在接受治疗的11眼中，角膜透明度都恢复了，并再生了单层角膜内皮结构；2年后所有患者的视力均有提高，11例患者中9例视力超过0.80(十进制视力)。这11例患者的视力结果首次表明，注射HCECs具有恢复HCECs的潜能[40]；5年的数据显示，术后3年、4年和5年角膜内皮细胞密度分别为(1384±451)个·mm-2、(1268±472)个·mm-2和(1257±467)个·mm-2，表明细胞密度随时间下降的趋势；持续5年，所有11例初始患者均保持再生角膜内皮的角膜清晰度，没有任何严重的不良反应，无论是局部的(如移植排斥反应、移植失败和无法控制的继发性青光眼)，还是全身性的不良反应。

但是该方法目前存在的局限性有以下几方面：(1)临床上符合条件的患者数量有限；(2)随访时间比较短；(3)缺乏与后弹力层剥除自动角膜内皮移植术或后弹力层角膜内皮移植术的随机比较研究；(4)该方法的成本效益；(5)临床应用的HCECs或组织的安全性和有效性的保证；(6) 移植的细胞是否会意外地输送到其他非靶器官等。因此，角膜内皮细胞注射的广泛应用还需更大样本量、更长随访时间的临床试验观察。

3 符合药品生产质量管理规范的细胞工程

只有可较大规模获得培养角膜内皮细胞，并且符合药品生产质量管理规范法规并通过批准后，靶向角膜细胞疗法才可能在临床上实行。大多数报道的方案在多个阶段仍然依赖于动物衍生的研究级产品，特别是胎牛血清或霍乱毒素。因此，异种污染和动物传播感染病原体的潜在风险可能会限制细胞治疗的应用[12]。一些研究小组最近修改了方案，以避免在细胞培养中使用动物源性产品，并使用自体血清和人类重组生长因子作为培养补充剂；同时研究表明，使用临床级3T3-J2饲养层细胞是安全的，不会导致细胞污染[41-42]。未来的研究重点将放在为角膜内皮细胞治疗开发无异种材料来源培养方案上。

4 小结

近二十年来，角膜内皮细胞的体外扩增技术和体内再生的发现推动了角膜内皮细胞治疗的进展。目前，第一个角膜内皮细胞治疗临床试验结果令人鼓舞，但仍需要进一步的研究和临床试验来改进治疗技术，从而确定这种新疗法的长期安全性和有效性。