环状非编码RNA在眼部疾病中表达研究进展△

侯乃方 徐鑫令 王欣玲

环状非编码RNA(circRNA)早在20世纪70年代于病毒中首次被发现，随着RNA深度测序和生物信息学的发展，在哺乳动物细胞中发现了大量circRNA。Memczak等[1]首次提出circRNA可以作为miRNA海绵参与基因的表达和调控，并在转录过程中发挥作用。自此，circRNA开始引起人们的广泛关注，并进行了相关研究。circRNA通常分为三种类型：外显子circRNA、外显子-内含子circRNA和内含子circRNA，大多数外显子circRNA存在于细胞质中，而另外两种主要存在于细胞核中[2]。circRNA在组织中具有特异性，并在发育阶段中大量表达，在多种细胞功能中发挥重要作用，包括细胞增殖、分化、

凋亡和血管生成等[3]。目前，circRNA的功能是一个具有挑战性的悬而未决的问题，目前circRNA的功能大致分为以下几种：作为miRNA海绵参与基因的表达，也是目前较多的研究方向；一些内含子保留的环状内含子RNA和circRNA也被报道为核内RNA poll转录的正调控因子；一些环状RNA可能会“海绵”其他因子，如RNA结合蛋白；circRNA生物发生过程本身也可能通过剪接和反向剪接之间的竞争来调节线性mRNA的形成[4]。目前，越来越多的研究发现了眼科疾病中失调的circRNA，本文主要对近年来circRNA在各种眼病中的表达、调节和功能等方面的研究进展进行综述。

1 circRNA与翼状胬肉

翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，其特征是结膜过度生长进入角膜，常发生于鼻侧睑裂区，翼状胬肉可以引起角膜散光，导致视力下降，如果遮盖瞳孔严重时会影响患者视力。其发病机制尚不明确，通常以成纤维细胞异常增殖和基质沉积为特征。Li等[5]对正常结膜组织和翼状胬肉组织进行转录组分析，并对差异表达的circRNA进行GO、KEGG分析发现，翼状胬肉组织中circ0085020(circLAPTM4B)表达上调，而circ0085020(circLAPTM4B)表达上调可显著提高翼状胬肉成纤维细胞的增殖和迁移能力，此外还可以阻止紫外线诱导的翼状胬肉上皮细胞凋亡。这一发现可能在翼状胬肉的预防、治疗甚至预防翼状胬肉切除手术后复发方面发挥作用。

2 circRNA与角膜疾病

角膜病是我国的主要致盲疾病之一，正常角膜缘和角膜之间的边界清晰，在病理条件下，角膜缘的血管穿透角膜，导致炎症、免疫原性和移植排斥反应等，导致角膜破坏。Wu等[6]对Wistar大鼠正常角膜和放置缝线的大鼠角膜通过荧光素酶实验和RNA免疫沉淀实验发现，cZNF609上调通过“海绵”作用使miR-184表达下调，miR-184通过减弱AKT/VEGF信号通路、抑制Wnt信号通路中的关键效应因子b-catenin/VEGF来调控角膜新生血管的生成。上述研究表明，cZNF609和miR-184有望成为角膜新生血管抑制的潜在靶点。Zhou等[7]建立了碱烧伤诱导的角膜新生血管模型，对无血管角膜和有血管小鼠角膜中差异表达的circRNA进行研究发现，cZFP609同源基因在血管化角膜中表达显著上调，表现出促血管生成因子VEGF相似的表达模式，cKifap3同源基因在血管化角膜中的表达显著下调，表现出抗血管生成因子PDGF相似的表达模式，且沉默cKifap3可以显著增强内皮细胞的增殖能力。该研究表明，cZFP609和cKifap3未来可能成为角膜新生血管预防和治疗的新型分子靶点。

角膜疾病主要有炎症、外伤、先天性异常、变性、营养不良和肿瘤等，其中淋巴管生成(LG)是新生淋巴管在伤口愈合、炎症和肿瘤转移等病理刺激下生长的过程，在眼部，病理性角膜LG与各种炎症疾病相关，包括角膜移植排斥反应、疱疹病毒性角膜炎、干眼和眼过敏等。Lin等[8]对人淋巴管内皮细胞(HLECs)circRNA表达的微阵列分析结果显示，处于炎症的人淋巴管内皮细胞中cZNF609可能作为miR-184的内源性海绵RNA，通过RNA沉默和转录后调节来使乙酰肝素酶(HPSE)过表达，HPSE过表达后诱导血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达增加，促进体内LG；HPSE水解功能也可诱导LG因子从非活化状态转化为活化状态，如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和血小板衍性生长因子(PDGF)，这一发现在LG级联反应中的结果或可成为角膜炎症性疾病预防和治疗的策略。

3 circRNA与白内障

白内障是指晶状体透明度下降或颜色改变所导致的视力下降的一种疾病，发病机制较为复杂，临床上分为年龄相关性、外伤性、并发性、代谢性、中毒性、辐射性、发育性和后发性白内障等，其中年龄相关性白内障(ARC)是最常见的类型。Liang等[9]对正常晶状体和ARC晶状体前囊膜的circRNA进行测序及分析发现，circZNF292是ARC患者晶状体前囊膜中下调的circRNA，它可能通过海绵miR-23b-3p参与抗晶状体上皮细胞氧化损伤和细胞凋亡，为ARC的防治提供了一个潜在的靶点。Cui等[10]研究表明，ARC患者晶状体上皮细胞中circHIPK3表达下调，miR-221-3p表达上调，提示circHIPK3表达下调与晚期白内障的进展有关。circHIPK3下调或miR-221-3p上调可抑制人晶状体上皮细胞(HLECs)增殖，提高丙二醛(MDA)水平，MDA是过氧化脂质(LPO)的代谢产物之一，是氧化应激的重要标志，表明ARC的发病与氧化应激有一定关系。此外，circHIPK3通过调节miR-221-3p下游的PI3K/AKT通路，保护HLECs免受损伤。为ARC的发病机制提供了新的认识，并为ARC提供了一个潜在的治疗靶点。Liu等[11]利用环状RNA测序技术来对混浊度1～2级的晶状体和ARC患者晶状体进行circRNA测序、分析发现，在ARC的皮质、核和后囊下囊膜中，HIPK3的表达明显下调，ARC患者circHIPK3水平降低促进了氧化应激下HLECs的凋亡并抑制了HLECs的增殖和上皮间充质转化。故HIPK3介导的HLECs功能障碍促进了ARC的形成和发展。circHIPK3的敲除显著提高了miR-193a的表达水平，该研究还证明了CRYAA是HLECs miR-193a的一个新的直接靶点，对维持晶状体透明度具有重要意义。故而circHIPK3可能通过circHIPK3/miR-193a/CRYAA调控网络来调节HLECs功能的研究揭示了一种潜在的新的使用基于circRNA的方法来预防和治疗ARC的方法。

4 circRNA与青光眼

青光眼作为目前全球第二位致盲性眼病，是一类以特征性不可逆性视神经萎缩和视野缺损为特征的疾病，病理性眼压升高是其危险因素。临床上分为原发性、继发性和先天性，原发性青光眼又根据房角的形态分为原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼。Chen等[12]研究发现，青光眼患者房水中circ0023826明显下调，并通过转录组差异分析确定Rab5b、Cltc和Dlg4是影响青光眼发病的关键基因，为青光眼的诊断提供了新思路。Wang等[13]研究发现，SD大鼠模型中cZNF609显著上调，可能与视网膜反应性胶质增生和胶质细胞激活，从而减少了视网膜神经节细胞(RGC)在体内的存活有关。CZNF609作为内源性miR-615海绵，抑制miR-615活性，导致陨石蛋白(METRN)增加。METRN是一种分泌型蛋白，控制神经发生、血管形成和胶质形成，在神经发生过程中，METRN在神经胶质细胞分化和轴突网络形成中发挥重要作用。该研究中发现的cZNF609-miR-615-METRN调控网络在青光眼导致的视网膜退行性疾病的治疗上提供了一个充满希望的靶点。

5 circRNA与糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病患者常见的微血管并发症，也是导致视力损害和致盲的主要原因之一。在糖尿病患者中，内皮细胞失衡可导致血管渗出和黄斑水肿，促进视网膜新生血管的生成。VEGF的异常表达和其他因素也被认为是DR血管功能障碍的基础[14]。Zou等[15]研究发现，人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)在高糖刺激下，circCOL1A2水平升高后，“海绵”miR-29b以促进VEGF的表达，从而导致DR病理过程中新生血管的生成。这提示circCOL1A2可能是治疗DR的一种潜在方法。Liu等[16]研究发现，miR-1243可与circ0002570、血管抑素(Angiomotin p80)直接竞争结合，在DR患者的视网膜前膜和高糖诱导的hRMECs中，circ0002570和Angiomotin p80显著高表达，而miR-1243表达显著降低，Angiomotin p80促进内皮细胞迁移，并促进内皮细胞向生长因子[如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)和溶血磷脂酸(LPA)]迁移。circ0002570通过circ0002570-miR-1243-Angiomotin p80轴，以竞争性内源RNA(ceRNA)模式调控DR的进展，可能成为临床治疗DR的潜在靶点。

6 circRNA与年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家最常见的致盲原因，也是全球第三大致盲原因。目前AMD的发病机制还不完全清楚，晚期AMD可导致中心视力进行性丧失[17]。在湿性AMD中，脉络膜新生血管(CNV)是导致视力丧失的主要原因。Zhou等[18]对激光诱导的CNV小鼠模型进行研究发现，在CNV模型小鼠中，cZBTB44表达显著上调，其作为miR-578海绵封闭和抑制miR-578活性，导致VEGFA和血管细胞黏附分子-1(VCAM1)表达增加。该研究中发现的cZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1轴可能成为治疗AMD等新生血管相关疾病的新靶点。Chen等[19]研究发现，在功能障碍的RPE和AMD患者血清中，circNR3C1表达下调。沉默circNR3C1使RPE特征性转录本和蛋白质减少，细胞吞噬功能中断，细胞内活性氧(ROS)生成加快，在活体内视网膜色素上皮(RPE)特征性标志物的表达减少，RPE的超微结构受到干扰，表现为RPE增厚，基底膜内折和外节扭曲，N3C1的沉默也使RPE特征性标志物的表达减少，并破坏了RPE的超微结构。circNR3C1作为内源性miR382-5p海绵隔离其活性，增加10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的表达，并抑制蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶标(AKT/mTOR)通路。故circNR3C1通过直接海绵包裹miR-382-5p来阻断其与PTEN的相互作用而阻断AKT/mTOR通路，从而阻止AMD的进展并保护RPE。因此，NR3C1补充剂是治疗萎缩性AMD的潜在方法。

7 circRNA与视网膜母细胞瘤

视网膜母细胞瘤(RB)是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤，通常表现为白瞳或斜视，在疾病后期，患者可能会出现眼球突出或眼球表面肿块[20]。Chen等[21]利用RT-qPCR检测RB组织和细胞系中circRNA和miRNA表达发现，RB组织和细胞系中circ0000527表达水平明显高于正常组织，circRNA通过“海绵”下调miR-646表达使得bcl-2 mRNA及其蛋白表达增加。当bcl-2表达增加时，可以阻断细胞凋亡信号、抑制活性氧、抑制钙离子释放来阻止细胞凋亡。总之，该研究揭示了circ0000527/miR-646/blc-2之间的调控机制，这对寻找新的RB诊断、治疗靶点具有积极的意义。Zhao等[22]研究发现，在RB细胞株中circ0075804过表达并正向调节E2F3的表达，导致RB细胞增殖、抑制细胞凋亡。E2F3基因敲除部分挽救了circ0075804在RB中过表达的促进作用。该研究为RB的治疗带来了新的希望。

8 小结

目前circRNA虽然越来越成为一个创新型的课题，但是其验证和识别技术在很大程度上仍在研究阶段，方法还有待标准化，需要进一步研究。目前很多circRNA在眼科疾病中调控异常已被人们发现，但是它们在这些疾病发生发展过程中的确切作用仍知之甚少，但circRNA作为内源性非编码RNA，在哺乳动物中具有较高的保守性，由于其较稳定的环状结构，对核酸酶不敏感，具有很好的稳定性，导致其可能成为疾病诊断和预后评估的潜在生物标志物，并为后期眼科疾病的治疗提供了新思路和新方向。