间充质干细胞治疗肠缺血再灌注损伤的研究进展

徐蕴馨，王清秀，2

(1.南京医科大学上海东方临床医学院，南京 211166；2.同济大学附属东方医院麻醉科，上海 200120)

缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion, I/R)是临床上许多疾病共同的病理生理过程，是由组织或器官血供减少乃致中断，随后缺血部位重获血供产生的损伤，再灌注不但无法恢复原有部位组织或器官的结构与功能，而且会加剧损伤[1-2]。胃肠道对I/R损伤高度敏感，即使是短暂缺血，局部黏膜组织也会发生实质性损伤。休克、腹部外伤、肠梗阻、器官移植、体外循环等应激状态均可导致肠I/R损伤[3-4]。肠I/R损伤致病因子多样，机制复杂，发病率、病死率逐年上升，目前临床仍缺乏有效的治疗手段和药物。

近年来，干细胞治疗技术快速发展。有研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在缺血性肠疾病中具有抗炎、免疫调节、抗氧化、血管再生、改善组织灌注、增强肠黏膜恢复能力、减少细菌从管腔转移到循环系统等作用[5]。本文对MSCs治疗肠I/R损伤的研究进展进行综述。

1 肠I/R损伤的发病机制

肠I/R损伤的发病机制十分复杂，涉及肠黏膜上皮细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)累积、Ca2+超载、线粒体损伤、炎症反应、细胞凋亡、微小RNA(microRNA，miRNA)的表达变化，且各机制间存在交互作用[6-8]。

缺血性肠损伤的初始阶段包括缺氧和对正常肠上皮黏膜屏障功能的破坏。虽然肠细胞可抵抗短暂的缺氧，但是长期的血液供应障碍会导致不可逆的细胞死亡。濒死的肠上皮细胞释放细胞内容物到细胞外基质中，与免疫细胞结合，引发炎症反应。这些细胞成分被称为损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，包括核酸、热休克蛋白等[9]。缺氧也会诱导黏膜层上皮细胞之间的紧密连接的破坏[1]。黏膜屏障功能被破坏，微生物及其产物-即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，从管腔转移到固有层，引发炎症反应。

通过手术、血管旁路移植术或药物溶栓重建血流，再灌注时胞内Ca2+超载、产生ROS会进一步加重缺血肠的损伤。线粒体Ca2+单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)驱动Ca2+进入线粒体基质以调节胞质内的Ca2+浓度，线粒体中Ca2+浓度增加会影响ATP的合成，并触发线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的开放，导致线粒体结构和功能障碍，最终引起细胞凋亡[10-11]。再灌注阶段，线粒体电子传递链损伤、花生四烯酸级联反应、中性粒细胞呼吸爆发等会产生大量ROS,超过机体抗氧化和清除能力，造成细胞损伤，这一病理过程，也被称为氧化应激[12]。ROS能改变信号转导因子、使肠黏膜脂质过氧化、使酶变性失活、DNA等，最终引发细胞凋亡，导致内皮功能障碍，进一步破坏肠道屏障，扩大炎症反应。研究表明，miRNA被认为是氧化应激相关信号转导的潜在靶标，这些信号被称为氧化应激反应性miRNA。细胞内ROS增加可以抑制或诱导miRNA的表达水平，从而通过调节其靶基因产生后续的生物学效应[13]。

肠道I/R损伤主要涉及炎症和血栓级联反应的激活。肠上皮的I/R损伤导致固有层内PAMPs和DAMPs积累。当DAMPs与细胞表面Toll样受体(Toll like receptor, TLR)结合时，激活转录因子如核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)以促进上调参与激活先天免疫反应的蛋白质，引发炎症反应并激活巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞以动员补体级联反应[14]。激活的白细胞滚动、黏附、渗出，并通过释放ROS、酶、化学介质等毒性物质造成细胞功能障碍、水肿，直至细胞死亡、组织受损；内皮细胞被激活，触发黏附分子表达和释放细胞因子到细胞表面或胞外，进一步促进炎性反应和凝血反应。白细胞-内皮聚集、血小板-白细胞聚集和组织中的液体积聚导致“无再流”现象，即使恢复血流供应仍然得不到灌注，导致持续的器官功能障碍[1]。

I/R损伤会损害肠道免疫防御并诱导内皮和上皮细胞功能障碍，导致内皮和上皮完整性破坏，肠内皮细胞受损加重微循环障碍，微血管通透性增加，肠组织水肿，肠上皮细胞的凋亡和细胞旁紧密连接的破坏将进一步促使肠黏膜屏障功能受损，细菌移位、大量内毒素释放入血，引起全身炎症反应综合征和多器官功能障碍，严重者发展为多器官功能衰竭[15]。

2 MSCs治疗肠I/R损伤的机制

MSCs是一类起源于中胚层的成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,可分化为多种间质组织,如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等，并具有独特的细胞因子分泌功能。MSCs根据来源可分为骨髓来源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪组织来源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells, ADMSCs)和围产期组织(脐带、羊膜、胎盘、Wharton’s jelly组织等)来源间充质干细胞。MSCs治疗肠I/R损伤的机制尚未完全阐明，很可能是通过以下途径中的一种或多种实现的[16]：(1)归巢、定植和分化；(2)抗炎介质、外泌体、miRNA和/或细胞因子的旁分泌释放；(3)细胞融合。

2.1 归巢、定植和分化

2009年，Karp等[17]建议将“MSCs归巢”定义为，MSCs在目标组织的脉管系统里被捕获，随后跨越血管内皮细胞迁移至目标组织的过程。当组织器官缺血、缺氧致损伤时，该损伤部位可能会表达特定的受体如炎性介质、趋化因子等配体，促进MSCs向着目标组织定向运输、黏附和浸润。Brittan等[18]发现，BMSCs在辐射引起组织损伤的情况下，迁移到肠固有层并分化为肌成纤维细胞，有助于肠组织再生。Zani等[19]发现，移植的MSCs可以通过归巢定植入受损组织并分化为受损细胞的表型来直接促进修复，或与肠道干细胞(intestinal stem cells, ISCs)相互作用，上调Wnt(wingless/integrated)/β-连环蛋白(β-catenin)通路，促进肠上皮的自动再生，维持肠黏膜形态的完整性和降低黏膜通透性。MSCs的归巢、定植和分化是MSCs治疗肠I/R的重要机制。

2.2 旁分泌

MSCs的治疗作用大多是通过旁分泌机制起效的。I/R时受损的肠道会释放促炎信号，激活MSCs以释放有益因子，这些因子会以旁分泌的方式发挥作用，治疗肠I/R损伤。旁分泌有多种不同的作用方式[20]：(1)分泌可溶性因子(细胞因子、生长因子、激素等)；(2)细胞间的相互作用，涉及在细胞间形成隧道纳米管(tunneling nanotube, TNT)；(3)分泌含有蛋白质和RNA的囊泡。旁分泌作用可以解释许多作用机制，包括免疫调节、抗炎、组织修复、血管再生和抗氧化性等。

2.2.1 免疫调节和抗炎特性 肠I/R时，缺血缺氧产生炎症因子，激活白细胞-内皮黏附相互作用，白细胞浸润组织，引起微循环障碍，进一步促使黏膜细胞释放炎症因子，级联放大炎症反应，加剧损伤。研究表明，I/R后肠功能器质性和功能性损伤程度与炎症因子和免疫细胞水平密切相关，因此通过调控炎症因子和免疫细胞，可以有效减轻炎症损伤[21]。MSCs通过增加抗炎细胞因子的产生和减少炎症介质的合成，可减少细胞因子介导的对肠上皮屏障的损害，最大限度地减少细菌易位，降低败血症的发生风险；通过释放各种旁分泌介质及与免疫细胞的直接相互作用，抑制固有免疫和适应性免疫，以促进组织结构的恢复和再生[22]。Inan等[23]发现，在Sprague Dawley(SD)大鼠肠I/R模型中，静脉注射BMSCs和通过肠壁局部给药至黏膜下区域，均可观察到BMSCs有效地迁移并定居到受损的肠道组织上，可抑制促炎细胞因子如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等的表达，增加抗炎细胞因子前列腺素受体EP3亚型和白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)的表达，减轻炎症损伤，在形态学上，全身给药疗效似乎不如局部给药显著，但从生化角度分析，全身给药似乎更有效。Koike等[24]通过向SD大鼠肠I/R模型静脉注射羊水来源间充质干细胞(amniotic fluid-derived stem cells, AFSCs)后发现,AFSCs会迁移并优先定居至I/R损伤区域，主要是回肠末端，通过分泌肿瘤坏死因子-α刺激基因-6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6,TSG-6)蛋白，减少中性粒细胞浸润、减少氧化应激、降低炎症标志物IL-6和TNF-α表达、调节巨噬细胞极性、影响参与伤口损伤和愈合的基因等保护作用，减少I/R引起的肠道损伤。

近年来，MSCs来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosome, MSCs-Exo)成为了研究热点。MSCs-Exo是一种直径为30～150 nm的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)，起源于多种细胞类型，包含来自原始细胞的核酸、代谢物、蛋白质等，并将内容物通过内吞、配体-受体和质膜融合等方式释放进其他细胞，介导细胞间通讯并影响受体细胞的生理和病理状况[25]。与细胞疗法相比，MSCs-Exo可降低免疫原性和致癌潜力，并且具有出色的生物相容性，可用于递送其生物活性成分。因此，MSCs-Exo可能成为MSCs移植的有前景的无细胞替代方案。巨噬细胞作为抗原提呈细胞，是固有免疫的重要组成细胞。研究表明，MSCs-Exo可促进M1型促炎巨噬细胞表型向M2型抗炎巨噬细胞表型极化，并增加抗炎细胞因子和趋化因子，调节免疫和炎症反应[26]。TLR是固有免疫系统的重要传感器分子，它的激活引起炎症级联反应，导致组织损伤。Liu等[27]研究发现，MSCs通过外泌体下调Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)/NF-κB信号通路传导，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，减轻组织炎症损伤，下调凋亡级联反应中关键蛋白酶含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)，减少细胞凋亡，稳定肺泡和上皮细胞，从而减轻由肠道I/R引发的急性肺损伤等多器官功能障碍综合征。

2.2.2 组织修复和血管再生 MSCs可旁分泌多种生物活性因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子、TGF-β、肝细胞生长因子等促进血管生成、抑制细胞凋亡、改变凝血级联反应、减少肠道损伤、改善肠道屏障功能、增强肠细胞增殖并修复坏死组织[28]。Jensen等[29]的研究表明，对C57Bl6J小鼠肠I/R模型腹腔注射ADMSCs，减少了I/R对肠黏膜、紧密连接蛋白如claudin-1和组织学结构的破坏，减轻了肠道局部和全身的炎症反应，改善了肠系膜灌注，提高了小鼠7 d存活率。Jensen等[30]在C57BL/6J小鼠肠I/R模型中，发现腹腔注射脐带间充质干细胞，可上调VEGF和血管生成素-2的表达，促进血管生成，改善肠系膜灌注，防止肠黏膜损伤，促进肠上皮屏障修复，增加抗炎细胞因子如IL-9、IL-10和趋化因子干扰素诱导蛋白-10(interferon inducible protein-10, IP-10)的表达，抑制促炎细胞因子的产生，限制炎症反应；并观察到敲除内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)基因后，削弱了脐带间充质干细胞对肠系膜灌注的改善和对肠道结构的保护作用，表明这些治疗作用可能是通过eNOS依赖性途径介导的。MSCs已被证明可以改善肠系膜灌注，但究竟是因为肠系膜血管舒张导致血流量改善还是由于血压和心输出量等全身参数改善所致，Te等[31]对此进行了研究，发现肠道缺血缺氧时，受损的肠细胞会释放炎症介质，激活MSCs旁分泌硫化氢(H2S)这一气体递质，H2S通过eNOS依赖性作用促进肠系膜小动脉的舒张，改善灌注，并且MSCs可以降低肠系膜血管中抵抗素与脂联素的比率，这两种激素的比例与eNOS相关，也可能是炎症的一个重要参数。Markel等[32]进行了一项研究，观察基因修饰MSCs使得产生更多内源性H2S能否提高疗效，发现：MSCs中，H2S主要由胱硫醚β-合酶、胱硫醚γ裂解酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶这三种酶产生，同时这些酶在压力刺激下也负责产生其他旁分泌介质如一些关键的细胞因子和趋化因子，因此，这一治疗干预可能会影响其他旁分泌介质，改变所需的有益效果。

2.2.3 抗氧化特性 正常细胞代谢过程中，产生的内源性抗氧化物能够及时清除体内的自由基和过氧化物，使组织细胞免受损伤。再灌注阶段产生大量ROS，超过机体抗氧化和清除能力，造成细胞损伤。再灌注诱导的氧化应激在I/R中起重要作用[12]。MSCs可以通过清除自由基、将功能性线粒体捐赠给受损细胞直接或间接表达抗氧化特性通过上调抗氧化酶增强宿主组织的抗氧化防御能力、免疫抑制特性避免ROS产生、调节炎症反应、增强细胞呼吸和线粒体功能，减少氧化损伤[33]。MSCs可以增加肠I/R损伤后小肠组织的抗氧化能力：MSCs通过归巢迁移至再灌注小肠，在受损组织中定居，通过对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性产生积极影响，增加肠道的抗氧化能力，降低体内脂质过氧化指标丙二醛的水平，减少氧化应激；通过清除氧自由基，抑制促炎细胞因子，增加抗炎细胞因子的表达，减弱炎症反应；减少细胞损伤，促进细胞增殖和血管再生，对受损组织有治疗作用[23]。

2.3 细胞融合

细胞融合是指来自不同谱系的2个细胞的质膜融合在一起，同时保留核的形态，是细胞间通信的一种形式。在特定条件下，部分细胞融合涉及细胞间直接而短暂的亚细胞细胞器(如线粒体)和蛋白质复合物的交换；若是永久的融合，细胞质成分和细胞器在这些细胞之间共享[34]。迄今为止，多项研究[35-37]表明，MSCs与心肌细胞、神经元和肝细胞存在融合反应，产生可以同时表达前体细胞和分化细胞特异性标记的杂交多核细胞。研究发现，细胞间连接的长度与传递线粒体的数量成反比：细胞间距离的延长导致传递线粒体的数量减少，因此，细胞融合会导致大量线粒体递送至受体细胞中[38]。已经证实，MSCs的修复功能部分由线粒体转移介导，线粒体从MSCs转移到受损细胞，可以改善氧化磷酸化，增加三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)产生，恢复线粒体功能，挽救受损细胞免于凋亡，修复细胞和组织的功能[39]。细胞融合在正常情况下是罕见的，启动细胞融合事件的因素仍在研究中，目前已知缺氧诱导的细胞凋亡、炎症或照射，都可以刺激MSCs与组织内分化的常驻细胞之间异位融合的频率增加，因而增强了线粒体转移和组织修复，同时再生组织中检测到的异核体增多[40]。已有研究[41]证明BMSCs和肠上皮细胞之间的融合事件。细胞融合在MSCs介导的肠道保护中的治疗效果有待进一步研究。

3 提高MSCs治疗效果

随着对MSCs研究的深入，对其在以下几个方面进行改造，可以提高疗效[42]：(1)通过病毒转染或CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)技术对MSCs进行基因改造，使MSCs具有更强的归巢效能或扩增能力。Kong等[43]的研究发现，用IL-37基因修饰的MSCs，对比单纯移植的MSCs，能够更有效地改善I/R后肠屏障功能和受损组织的微环境，降低NLRP3(NLR family, pyrin domain containing 3)炎症小体和下游级联蛋白合成，抑制其介导的促炎信号通路，降低局部和全身炎症反应。(2)用小分子、缺氧或生物材料的结构刺激来启动MSCs，以改善MSC的功能、存活和治疗效果。Liu等[44]的研究发现，预处理IL-1β可通过激活环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)-前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)信号轴启动ADMSCs并增强ADMSCs的旁分泌功能，活化的ADMSCs在体内调节与中性白细胞趋化性、炎症反应、防御反应等相关的基因的表达，并抑制NF-κB p65，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)-细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)途径，减少细胞凋亡和抑制炎症，显著增强对小鼠肠道I/R损伤的修复作用，增强了ADMSCs的治疗效果。Yan等[45]发现，小鼠肠I/R后，给予可高效表达血红素加氧酶-1(HO-1)的BMSCs，可比单纯移植BMSCs在提高存活率、减轻肠损伤方面有更显著的改善，并能更有效地抑制炎症反应。(3)通过为MSCs黏附提供支架来提高MSCs的存活和功能的生物材料策略，包括对生物材料的维度、刚度、表面化学和微观结构的修改。BMSCs通常使用细胞外基质支架运送到移植部位。现研究热点是研发合成聚合物支架，合成聚合物是高度可调、均质且无细胞的材料，具有高批次一致性，以多孔水凝胶、海绵、平板或膜的形式存在，但其独特的性质可能对MSCs功能产生不同的影响[46]。(4)利用MSCs分泌组如分泌蛋白、EVs等作为药物输送平台进行治疗。MSCs-EVs的特性包括循环稳定性、良好的生物相容性、低毒性和免疫原性，已有研究证明，MSC-EVs在多种疾病中具有与MSCs相同甚至更好的治疗效果[47]。

4 展 望

肠I/R损伤是一个复杂的多因素紧密联系、相互影响、交互作用所产生的病理生理过程。目前，针对肠I/R损伤的传统经典疗法，主要以预防和对症处理为主，缺乏更理想高效的治疗方法。MSCs在肠I/R损伤中的应用有着十分广阔的前景。大量研究已经证明，MSCs在免疫调节、抗炎、组织修复、血管再生、改善灌注和抗氧化应激等方面有着强大的治疗作用。将MSCs应用于临床，也面临着许多挑战：不同来源(如骨髓、脂肪组织、脐带或肌肉)分离的MSCs有着不同的的分化潜力和不同程度的稳定性；不同培养条件下MSCs的增殖能力水平不同；不同给药途径(局部/全身)、注射部位、输注时间和细胞载体材料等因素会对MSCs的归巢或迁移能力造成影响。随着研究深入，研究热点开始从单纯使用MSCs转向对MSCs进行可塑性研究如基因修饰、预处理，与药物或化学物联合使用，使用无细胞疗法MSCs-Exo等，以期打破MSCs应用时的一些限制条件和缺点的制约，并提高疗效。尽管MSCs应用于肠I/R损伤尚处于基础研究阶段，但却给肠I/R损伤的治疗提供了新思路。