免疫抑制性细胞在免疫性血小板减少症中的作用

陆 皓，陈海琳，鲍计章，周永明

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院血液科，上海 200437）

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）又称为特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一种由抗体和细胞介导的血小板破坏增多所引起的自身免疫综合征，该病患者比正常人群更具出血倾向[1]。关于ITP 的发病率，国内尚无确切的资料，来自国外的研究估计成人ITP 的年发病率约5/100,000～10/100,000[2-4]；而我国台湾地区以及美国、法国的研究都发现在在幼儿和老年人中ITP 的发病率更高[3-5]，同时美国及法国的研究数据显示，总体而言女性的发病率略高于男性[3，4]。导致抗血小板自身免疫的最初事件尚不清楚。在非病理条件下，免疫系统受体液和细胞成分的精细调节。目前已经发现，ITP 患者的T 细胞异常，辅助性T 细胞Th1/Th2 比值失衡，T 细胞对自体血小板的细胞毒性增强。ITP 又存在由B 细胞产生主要针对血小板表面蛋白的自身抗体增强，对患者血小板上表达的自身抗原失去免疫耐受。而自体反应性T 细胞的异常增殖导致对血小板抗原免疫耐受性的破坏，可能是产生自身抗体B 细胞增殖上调的原因[6]。越来越多的研究表明，包括调节性T 细胞（Tregs）、调节性B 细胞（Bregs）、骨髓来源抑制性细胞（MDSCs）、间充质基质细胞（MSCs）等在内的免疫抑制性细胞在ITP 发病过程中发挥着重要作用，了解其相关机制有望为ITP 的靶向治疗提供新的途径。

1 调节性T 细胞

Tregs 存在于健康人外周血和脾脏中，占单个核细胞1%～2%，CD4+T 淋巴细胞的5%～10%，在自身免疫性疾病的发生和发展中起重要作用[7]。Tregs 是限制免疫和保证免疫耐受的关键检查点，目前研究较多的是检测CD4+CD25+Treg 细胞。与正常对照相比，ITP 患者，尤其是活动性ITP 患者和未缓解ITP患者，其外周Treg 数量明显减少[8-10]，而治疗有效的ITP 患者，Treg 数量会增高[11-15]。

此外，滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cell，Tfh）为新近发现的效应性T 细胞亚群，是辅助生发中心B 细胞产生抗体的主要细胞，其作用可被滤泡调节性T 细胞（follicular regulatory T cell，Tfr）所抑制。梁兴林等[16]研究发现，ITP 患者CD4+T 细胞中Tfh 细胞比例高于健康对照组，Tfr 细胞比例、Tfr/Tfh 比值低于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。因此认为，Tfr/Tfh 比值失衡在ITP 发病过程中可能起到重要的作用。

目前已发现有些药物在改善ITP 患者疗效的同时可提升Treg 细胞水平。如新诊断为ITP 的成人患者CD39+Treg 细胞不仅数量减少，而且CD39 酶活性受损。大剂量地塞米松治疗后，上述两种缺陷均见逆转[17]。有研究[18]对72 例ITP 患者分别采用常规剂量和大剂量地塞米松治疗7～14 d 后，结果显示患者血小板计数提高，同时CD4+CD25+Treg 细胞水平明显提高，且大剂量地塞米松疗效及Treg 细胞水平均明显优于常规剂量组。

目前，以Treg 为靶标的ITP 治疗取得了不小进展。然而，Treg 功能的恢复是缓解疾病的直接原因，或仅仅是免疫耐受恢复的一个标志尚不清楚。因为，也有研究表明ITP 患者外周血中CD4+CD25-Foxp3+水平表现为升高[19]；另外还有研究表明，ITP 患者在外周血中以CD4+CD25highFoxp3+定义的Treg 细胞与正常对照无差异[20-22]，但在其他组织如骨髓和脾脏中Treg 数量也是减少的[20，21]。出现以上不同的研究结果，可能在于ITP 患者的发病机制具有异质性，也可能与所述研究的样本量大小、疾病活动程度、年龄、种族差异性等因素有关。值得强调的是，Treg 细胞有不同标志物不容忽视，目前为止，检测到的Treg 细胞的标记物不同，包括CD4+CD25+、CD4+Foxp3+、CD4+Foxp3+CD25+、CD4+Foxp3+CD127low/–、CD4+CD25+CD127low/–等不同表型[23]。

迄今大多数研究表明，Treg 的数量和功能的异常在ITP 发病中起到了一定的作用，较低的Treg 频率导致自我耐受性的下降，据此可以为开发特异性免疫调节疗法奠定基础。此外，Treg 频率对儿童慢性ITP 的自然过程和长期结局具有预后意义[11]。

2 调节性B 细胞

Breg 是B 细胞的一种亚型，Wolf SD 等[24]首次提出了B 细胞在自身免疫性疾病具有负性调节作用。Mizoguchi A 等[25，26]将其命名为调节性B 细胞，并认为Breg 可以通过产生负向细胞因子（如IL-10与TGF-β）参与免疫调节或通过细胞与细胞间的直接接触而发挥负向免疫调节作用。目前Breg 细胞表面标志物报道众，Claudia M 等[27]统计人类Breg细胞免疫分型包括CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD24hiCD27+、CD19+CD38+CD1d+IgM+CD147+、CD25hiCD71hiCD73lo、CD27intCD38hi、CD39+CD73+等。目前认为[28，29]，Breg 在ITP 患者外周血中明显低于正常对照组，Breg 可通过分泌细胞因子IL-10 及TGF-β 抑制反应性T 细胞的活性及抑制B 细胞产生抗体，并能促进Treg 的分化与增殖而介导机体免疫耐受，其功能失调及数量减少可能导致自身免疫病的发生。

ITP 患者体内存在Breg 的免疫缺陷，探讨针对Breg 靶向治疗，抑制ITP 的发生发展，可望为ITP 的治疗提供新的思路。Fang J 等[30]研究发现，49 例ITP患儿CD19+CD24highCD38high Breg 的频率明显低于正常对照组，经甲基强的松龙加静脉注射免疫球蛋白治疗后，CD19+CD24highCD38high Breg 水平基本恢复正常。韩晓丹等[31]给予ITP 患者利妥昔单克隆抗体、地塞米松、环磷酰胺治疗2 周，结果发现12例患者中6 例（50.00%）获得完全缓解，4 例（33.33%）部分缓解，总有效率达83.33%；此外，患者的血小板计数和外周血中Breg 细胞、Treg/Th17 比值较治疗前升高，差异均有显著统计学意义（P＜0.05）。

总之，以Breg 细胞为靶标的研究虽取得了一定进展，但是在一个复杂的分子网络中，Breg 细胞作为一个调节细胞和效应细胞在多大程度上发挥作用仍具有很大深入探索空间。

3 骨髓来源的抑制性细胞

MDSCs 是一群来源于髓系，且未分化成熟的异质性免疫抑制细胞，其特点是能够显著抑制T 细胞应答，并在肿瘤、炎症和感染等状态下扩增[32]。MDSCs 的表型是异质的，但这些细胞大多是人类的CD33+/CD11b+/HLA-DR-未成熟髓样细胞[33]。MDSC通过分泌精氨酸酶、一氧化氮合酶（iNOS）和活性氧（ROS）抑制T 细胞异常活化[34]，与Treg 细胞具有相似的功能。此外，MDSC 对Treg 细胞的分化和成熟至关重要[35]。由于Treg 细胞在ITP 发病机制中具有重要作用，因此推测MDSCs 也可能参与ITP 的免疫失调机制。大量研究表明[36-38]，经糖皮质激素治疗后完全缓解的ITP 患者的MDSCs 数量明显高于对照组；同时新诊断的ITP 患者的MDSCs 明显高于复发的ITP 患者，同时低于完全缓解组。但目前针对MDSCs 为靶标的ITP 疗效相关性研究数量尚有限。有关MDSCs 在ITP 发生发展中的作用有待进一步深入研究，期待有新的发现。

4 间充质基质细胞

MSCs 是一种间充质来源、非造血的干细胞，具有自我更新的能力。骨髓源性间充质干细胞（BMMSCs）是造血微环境中的重要组成部分，分泌多种细胞因子，包括白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10、白介素11、前列腺素、干细胞因子（SCF）和白血病抑制因子，可诱导巨核细胞的生物发生和成熟。而巨核细胞生成的任何阶段的改变都会影响血小板的产生。MSCs 可通过改变树突状细胞、效应T 细胞（Th1 和Th2）和自然杀伤细胞的细胞因子分泌功能，在生理条件下诱导免疫抑制或耐受表型。这些细胞最重要的特性之一是它们的免疫抑制功能，包括适应性和先天性免疫反应。在不同的自身免疫性疾病中观察到MSCs 的功能损害。MSCs 缺陷在ITP 的发病机制中也起着作用[6]。研究表明[39]，ITP 患者的MSCs 的特点是凋亡细胞数量增加，抑制活化T 细胞增殖的能力降低。有缺陷的骨髓间充质干细胞目前正在被探索作为治疗ITP 的潜在靶点。有报道称血小板衍生生长因子（PDGF-BB）对MSCs 具有保护作用。PDGF-BB 具有抗细胞凋亡、衰老和免疫调节功能紊乱的作用。一项临床研究显示[40]，4 例ITP 患者接受人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗，其中3 例患者在12 个月内达到完全缓解，1 例患者在24 个月内达到完全缓解。hUC-MSC 移植至产生效应的中位时间为12.5 d。首次hUC-MSCs 移植后未使用其他免疫抑制药物，hUC-MSC 移植期间及术后（中位随访期17 个月）均无严重不良反应，因而hUC-MSC 移植是治疗慢性难治性ITP 的一种合理的抢救性治疗方法。

MSCs 具有免疫调节特性。Ping Z 等[41]对ITP 小鼠采用BM-MSC 移植治疗发现，ITP 小鼠血小板（PLT）计数显著升高；与此同时，BM-MSC 组细胞因子（TGF-1、IL-10）、Treg 细胞比例、Foxp3 mRNA 表达水平均明显增高。该研究结果表明，BM-MSCs 主要通过分泌抑制细胞因子和上调Treg 来提高PLT计数，这可能为人类ITP 治疗提供新的方案。另一些研究也有类似发现，陶艳玲的研究显示[42]，BM-MSCs治疗可以升高ITP 小鼠血小板水平，对ITP 小鼠治疗具有一定的效果；其有效的治疗机制可能与调节Treg 水平和抑制Th1 细胞分泌促炎细胞因子，促进Th2 细胞分泌抗炎细胞因子有关。体外实验发现[43，44]，MSCs 可显著上调ITP 患者及正常人T 淋巴细胞中CD4+CD25+T 淋巴细胞比例及CD4+CD25+/CD4+比值，下调ITP 患者CD8+T 淋巴细胞增殖，抑制ITP 患者Th1 类细胞因子的表达。

5 耐受性树突状细胞

树突状细胞（DC）在免疫系统中扮演免疫应答和免疫耐受两个角色，其免疫应答功能主要包括抗原提呈（主要由imDC 执行）和免疫激活（主要是mDC 发挥作用）。而发挥免疫耐受功能的DC，被称之为耐受性树突状细胞（tDC）或DCreg。tDC 通过参与中枢耐受期间胸腺中自反应T 细胞的阴性选择来促进免疫耐受[45-47]。DC 还通过各种机制，包括如细胞因子IL-10、IL-27 和TGFβ 的表达，限制吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的表达，并控制细胞外水平的三磷酸腺苷（ATP）和腺苷[48-54]，限制效应T 细胞并促进外周血Treg 分化。有研究证实[55]，在ITP 小鼠模型中，tDC 可抑制血小板计数的下降和血清IFN-γ 水平的升高。树突状细胞（DCs）可与Tregs 相互作用，诱导耐受性表型。研究发现，DCs 除了具有免疫原性外，通过表达免疫调节酶吲哚胺2，3-二加氧酶1（IDO1）诱导Treg 来维持自身抗原耐受性也至关重要；反过来，Treg 会调节DCs 的成熟度和/或功能。ITP 患者显示成熟DCs 将T 细胞转化为Treg 的能力降低。此外，Treg 产生IL-10 能力降低。总之，ITP患者Tregs 和DCs 之间的交互作用受到阻碍,并起到致病作用[54，55]。动物实验发现[56]：耐受性树突状细胞可以经尾静脉迁移至脾脏并发挥作用，从而明显升高ITP 小鼠的血小板数目、降低体内IFN-γ 的水平；耐受性树突状细胞缓解ITP 小鼠症状的治疗机制可能是通过上调小鼠体内Treg 细胞的比例实现。

6 自然杀伤细胞

NK 细胞是一类在宿主防御和免疫监视中发挥着重要作用的天然淋巴细胞[57]。既往认为NK 细胞的主要作用是杀伤细胞，但是越来越多的研究表明NK细胞不仅是重要的固有免疫细胞，同时也具有调控适应性免疫的作用。NK 细胞不是单一功能的同源性细胞群，而是具有多种不同功能的亚群。局部微环境和特定的细胞间接触可以决定NK 细胞的发育和功能。在病理过程微环境中，NK 细胞在接触局部炎症因子后诱导程序性分化和增殖，最终产生具有不同功能的亚群。魏海明等[58]按照功能将这些亚群分为NKtolerant、NKcytotoxic 和NKregulatory 等。近年有研究发现，NK 细胞作为一种免疫调节细胞，在ITP患者外周血中数量减少，发育障碍、功能降低[59-61]。张玉娇研究[62]发现，ITP 患者体内NK 细胞数量及功能下降，其分化发育过程亦存在异常，且ITP 患者外周血中NK 细胞比例与血小板计数呈正相关，与杀伤T细胞及B 细胞呈负相关。因此认为ITP 患者外周血NK 细胞数量及活性的下降导致其对自身反应性B 细胞及杀伤T 细胞抑制功能下降，从而导致疾病的发生和发展。但也有研究发现，原发性ITP 患者外周血CD3-CD56+NK 细胞均在正常范围内，未观察到明显抑制或激活NK 细胞受体的表达发生重大变化，相比之下，ITP 患者NK 细胞产生IFNγ 的水平低于健康对照组[63]。虽然不同研究结果存在差异可能基于ITP 发病机制存在异质性，但NK 细胞在ITP 发生发展中是否起作用，如何起作用有待进一步论证。

7 巨噬细胞

巨噬细胞源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。因此，巨噬细胞也可看作一种髓原性细胞。巨噬细胞是具有多种作用的异质性细胞，在先天性免疫和适应性免疫中起着关键作用。根据外界不同的刺激，巨噬细胞可以向不同的方向极化，主要分为M1 型巨噬细胞，亦称为经典活化的巨噬细胞，以及M2 型巨噬细胞，也称为替代活化的巨噬细胞，分别与T 细胞亚群中Th1 型和Th2 型细胞的功能相对应，具有不同的免疫功能。M1 型巨噬细胞为促炎型，主要分泌TNF-α、IL-1β 等炎症因子；M2型巨噬细胞为抑炎型，主要分泌IL-10，TGF-β 等细胞因子，可以诱导Tregs 细胞的生成[64]。近年许多研究发现，ITP 患者的单核细胞源性巨噬细胞M1 标记物表达增加，免疫抑制功能受损，即M1 标记的巨噬细胞极化异常，M1/M2 失衡参与了ITP 的发病机制。有实验表明，促进M1 型巨噬细胞凋亡，上调M2型巨噬细胞表达，有可能促使原发性ITP 使疾病得到缓解[65]。地塞米松（HD-DXM）已被公认为ITP 患者的一线治疗用药[66，67]，全反式维甲酸（ATRA）也具有广泛的免疫调节作用，也被应用于多种药物治疗无效的ITP 患者中[67]。临床观察发现，与健康对照组相比，ITP 患者的巨噬细胞具有更高的吞噬能力。在ITP 患者中，单核细胞和巨噬细胞中检测到TNF-α的分泌增加，巨噬细胞可以直接破坏血小板。HDDXM 或ATRA 治疗，通过降低M1 标记表达和增加M2 标记表达可纠正M1/M2 失衡。此外，HD-DXM或ATRA 调节的巨噬细胞抑制CD4+和CD8+T 细胞增殖，并扩增CD4+CD49+LAG3+1 型T 调节细胞，使T 细胞因子向Th2 方向移动，即使用HD-DXM 或ATRA 治疗后，应答者表现出明显诱导出巨噬细胞M2 样表型和免疫抑制功能[33，68]。这些发现揭示了ITP 的新机制，为ITP 的治疗提供了新的策略。

8 总结

ITP 的发病机制非常复杂，患者对不同治疗的反应非常不一致，但ITP 是一组具有共同特征的疾病，即对血小板抗原免疫耐受丧失和原发凝血功能障碍，免疫失调是其本质。随着研究的深入，调节性免疫细胞的负性调节作用越来越受到重视。其中Treg 无疑在免疫抑制中扮演了重要的角色，对于ITP 的发病与治疗都有十分重要的意义。虽然免疫抑制性细胞在ITP 发病过程作用的研究还有待深入，但是现有的研究已充分显示包括调节性B 细胞、骨髓来源的抑制性细胞、间充质基质细胞、耐受性树突状细胞、NK 细胞、巨噬细胞等细胞所起的作用也不可忽视。大量研究表明，ITP 的发病不是单单一类或几类免疫细胞数量或功能发生异常而导致的，围绕着Treg、Breg 及各种细胞共同参与织就了一张免疫失调的“大网”。理清这些细胞间的关系及相互作用有助于更好的探索ITP 的真正病机，尤其是探明这些细胞的共同通路以及细胞因子相互作用有助于提高对ITP 发病机制的认识，从而提高临床对该病的治疗。