多发性特发牙颈部外吸收患者TNFRSF11A基因突变分析

刘佼佼， 王 晨， 赵祥宇， 董囡囡

1.北部战区总医院 口腔科，辽宁 沈阳 110016；2.大连市第二人民医院 口腔科，辽宁 大连 116031；3.沈阳市口腔医院，辽宁 沈阳110002

特发性牙颈部外吸收是临床上的罕见病，而多发性特发牙颈部外吸收(multiple idiopathic cervical root resorption，MICRR)则更为罕见，其发生在上皮附着下方的牙根颈部表面，是牙周膜中吸收性细胞进行性破坏牙体硬组织的结果[1]。MICRR发生在同一牙列中，同时累及超过3颗牙齿，其特发性表现为无相关口腔疾病、无全身系统疾病及无家族遗传性。MICRR发病率低，病因复杂不明，因其特殊的发生部位及侵袭性特征，早期发现较为困难，临床治疗难度高，患牙预后不良导致多数被拔除[2]。RANKL-RANK-OPG轴是破骨细胞分化和功能的中央调节剂，其突变会导致骨骼异常相关疾病[3]。其中，编码蛋白质RANK的TNFRSF11A基因发生突变是造成多种溶骨性骨改建异常疾病的原因，如家族性消耗性骨质溶解症、畸形性骨炎和消耗性骨高磷酸酶症，这3种疾病患者TNFRSF11A基因1号外显子上均有串联性重复发生[4-6],且均伴有牙根外吸收性病变[7]。目前，国内外对MICRR的相关基因学研究少见报道。本研究旨在探讨MICRR患者的TNFRSF11A基因突变情况。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究纳入2例MICRR患者、1例家系成员及5例健康者为研究对象。MICRR诊断根据X线影像牙颈部区域的透射影及环绕髓腔外周的牙本质层的阻射影[8]。健康者为各项常规性检查及口腔临床检查确认为无系统性疾病及MICRR者。病例1，男性，16岁，右上前牙因松动致拔除一周余，一周前曾因“牙周感染”拔除13。病例2，女性，23岁，左上颌前牙咬硬物疼痛四月余，10余年前曾经佩戴全牙列固定矫治器进行正畸治疗1.5年。2例患者均无系统性疾病史、颌面部外伤史；家族成员中无类似疾病发生；无特殊嗜好及药物过敏史。2例患者X线影像检查均可见涉及上下颌多个牙齿的牙根颈部不同范围的X线透射影，范围从局限于牙根颈1/3到累及牙冠颈1/3不等。所有患牙根管腔外均有线状阻光带包绕根管外形。与被吸收根颈部相邻的牙槽嵴骨密度减低。其中，除病例2患者的22根颈部被完全吸收致冠根分离外，虽锥束计算机断层扫描(cone-beam computed tomography，CBCT)显示缺损区域较大，但大多未累及牙髓。见图1、2。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

图1 病例2患者21牙CBCT图像(矢状位) 图2 病例2患者25牙CBCT图像(矢状位)

1.2 研究方法 采集所有研究对象清晨空腹血液样品4.0 ml,K2EDTA抗凝，备检。采用基因组DNA试剂盒(Promega，美国)提取外周血DNA，按试剂盒说明书操作。提取的产物DNA定量。以提取到的基因组DNA为模板，以GenBank公布的TNFRSF11A基因序列为参考序列，设计引物对TNFRSF11A基因1号外显子序列(113bp)进行PCR扩增。目标DNA扩增产物分子量为415 bp。引物设计如下，上游引物：5，-ACCGCAAACCAGGGGAGCTT-3′，下游引物：5′-CTCCCCAGCTTCCCACGGC-3′。PCR反应总体积为50 μl。测序PCR热循环条件：94℃、3 min(98℃、10 s，58℃、10 s，72℃、30 s)，共35个循环，72℃、5 min，4℃保温。采用普通琼脂糖凝胶DNA(天根生物)回收试剂盒进行目的片段的回收，按试剂盒说明书操作。委托北京奥科生物技术有限责任公司进行纯化及测序鉴定。

1.3 统计学方法 测序结果采用Sequencher 5.0软件与GenBank提供的序列进行比对分析。

2 结果

2.1 受试者基因组DNA提取后电泳结果 将提取后的受试者基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，显示为一高分子量的单一条带。见图3。

图3 基因组DNA提取(M为 HindⅢ/λ DNA分子量标准；1～2为MICRR患者DNA；3为家系成员DNA；4～8为健康者DNA)

2.2 TNFRSF11A基因1号外显子获取后的电泳结果 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，显示为一单一条带，分子量为415 bp。见图4。

图4 TNFRSF11A 基因1号外显子的获取(M为DL2000 DNA分子量标准；1～2为MICRR患者TNFRSF11A基因1号外显子；3为家系成员TNFRSF11A基因1号外显子；4～8为健康者TNFRSF11A基因1号外显子)

2.3 目的片段纯化后的电泳结果 将切胶回收后的目的片段(PCR产物)进行琼脂糖凝胶电泳，显示为一单一条带，分子量为415 bp。见图5。

图5 目的片段的纯化(M为DL2000 DNA分子量标准；1～2为MICRR患者DNA；3为家系成员DNA；4～8为健康者DNA)

2.4 纯化后PCR产物的测序结果 3′ACCGCAAACCAGGGGAGCTTGGGCACCACCTGGCTGGCA CCGCCGGGCCCGGCCGGAGGGGGGCGCAGGAGGG CGGCGCGGGGGCAGGTGCGGGGCGGGGCACGGGG GCGGGACCACACAGGGCCGCGGCAGCCGCGCCCG CTGGGCCACAGAGGCCGCTGAGGCCGCGGCGCCC GCCAGCCTGTCCCGCGCCATGGCCCCGCGCGCCCG GCGGCGCCGCCCGCTGTTCGCGCTGCTGCTGCTCTG CGCGCTGCTCGCCCGGCTGCAGGTAAGGAGCGCCC GCGCCTGCCGGGCCGCGCGGCCCGACGCCTCCTCG GGAGCCCCGGGAAGGGCCGGGGCCGGCGGCATCCT GGCTCCTCCGCCTT5′

2.5 序列同源性的比对 将测序结果与GenBank公布的序列进行比对，未发现目标基因位点，编码蛋白质RANK的TNFRSF11A基因1号外显子有突变发生。测序片段(上)与正常序列(下)一致，即所得序列与已公布序列的同源性为100%。见图6。

图6 序列同源性比对结果

3 讨论

MICRR发病率低，国内外相关报道仅数十例，多发于年轻女性[9-11]。由于MICRR病变发生在除牙髓外的牙体组织内，因此，即使到了晚期也常无任何症状。MICRR患牙一般仍为活髓，对电活力检测及叩诊反应也多在正常范围内，多由常规X线检查时偶然发现[12]。本研究的2例MICRR患者均在咬硬物引起患牙病理性根折并疼痛，就诊时经X线检查显示多数牙齿牙根外吸收引起注意。病例2患者否认系统性疾病史、颌面部外伤史及家族史，曾于10余年前接受过全牙列固定矫治器进行正畸治疗1.5年余。虽然急性(牙合)创伤、过度矫治力和牙冠内漂白等是根颈部吸收的病因，但由于正畸治疗结束距发现该病间隔久远，因此，不能确定该治疗是其多数牙齿牙根外吸收发生的直接病因[13]。

由于等位基因发生突变的频率随着受检对象的不同而有区别[14]，本着同族人群的原则，本研究选取了汉族健康者为对照，以消除有可能因人种不同而形成的干扰。健康者经由各项常规性检查及口腔临床检查确认为无系统性疾病及MICRR。OPG、RANK、RANKL是偶联成骨细胞、基质细胞和破骨细胞分化、活化与生物活性的3种主要细胞因子。TNFRSF11A是编码蛋白质RANK的基因，其在骨组织内高度表达，且在破骨细胞的分化活动中发挥着重要的作用。有研究发现，TNFRSF11A基因发生突变是造成多种异常性骨吸收病变的原因，此类突变导致RANK的信号肽区域产生了新的氨基酸插入，肽结构的改变降低了信号肽的正常裂解，增加了RANK的信号传导，破骨活动增强[15]。值得注意的是，家族性消耗性骨质溶解症患者的主要牙齿病变特征是涉及多个恒牙的特发性根颈部吸收和牙髓组织的多发性髓石，在临床表现、好发年龄和组织病理学特征上与MICRR类似[16]。而一项有关正畸导致的根尖部外吸收的基因学研究表明，基因TNFRSF11A的多态性与上颌中切牙根尖部外吸收有关联[17]。另有研究对家族性MICRR患者的30年随访报道中也提示致病基因存在的可能性[18]。以上研究提示，特发性牙颈部吸收，特别是MICRR的发病可能存在遗传学基础。因此，笔者推断MICRR的发病可能也与该基因某种形式的突变有关。

本研究得到的序列经与GenBank公布的序列比对后，未能发现目标基因位点，即MICRR患者编码蛋白质RANK的TNFRSF11A基因1号外显子无突变发生，可初步说明该疾病的发生与此基因位点无关。但因本研究纳入例数较少，且研究操作过程中可能有误差产生，因此，两者之间的关系尚不能定论。由于在RANKL-RANK-OPG轴中，编码RANKL、RANK及OPG的基因分别有5、10和5个外显子，所以该疾病的致病基因突变可能存在于其他相关基因中，进一步外显子测序将有助于致病基因的确定。

综上所述，多发性特发牙颈部外吸收患者TNFRSF11A基因1号外显子无突变，排除其为该疾病致病基因的可能性。