体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M

刘思颖，王斌，潘力

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

甜叶菊原产于巴拉圭和巴西，其叶片中可提取出 一类甜度高且热量低的糖苷类化合物，几个世纪以来，一直被南美洲人作为天然甜味剂食用，包括甜菊苷（Stevioside，ST）、莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，RA）、莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，RD）和莱鲍迪苷（Rebaudioside M，RM）。其中ST和RA含量较为丰富（约占叶片干重的7%和3%），但与RD和RM相比，它们的甜度较低，且随添加量不断增加，苦涩味逐渐显现，故应用于食品生产时会影响产品风味[1]。RD和RM作为高品质甜味剂，甜度为蔗糖的400倍，口感更加纯净，但是含量十分稀少，仅占叶片干重的0.3%[2]。利用传统物理方法从叶片中提纯RD和RM的产量远远不能满足市场需求，且生产量少，工艺繁琐，成本较高[3,4]。

甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1可以在糖基供体UDPG存在的条件下，催化两种糖基转移反应：由ST生成RA[5]，或由RD产生RM[6]，而水稻来源的糖基转移酶EUGT11则可以利用糖基供体UDPG，以RA为底物催化生成RD[7]，糖基转移酶UGT76G1和糖基转移酶EUGT11都属于UDP糖基转移酶。在以上三个糖基转移反应中，均需要UDPG作为糖基供体，但UDPG价格昂贵，使甜味剂的生产成本大幅增加。而蔗糖合成酶可利用廉价原料UDP，在蔗糖存在的情况下，将葡萄糖基转移至UDP，生成UDPG和果糖（图1b），且该过程可逆，可以实现UDP-UDPG的循环反应[8-11]。当糖基转移反应与SUS1介导的UDP-UDPG循环反应偶联时，不需要添加昂贵底物UDPG，各糖基转移反应也能正常进行。

由于新型甜味剂RM更加符合人们对食物品质的追求，但目前关于体外一锅法高效合成RM的论文报道较少。本文将UGT76G1，EUGT11和SUS1分别于大肠杆菌中重组表达，利用其破碎得到的粗酶液建立多酶级联反应体系，即将三个单级联反应串联，在体外形成通路，由廉价原料ST经一锅法合成RM（图1a，1b）。并通过提高该通路中限速酶EUGT11酶活，将终产物RM产量提升，该方法避免直接用昂贵的RD作为合成RM的底物，为低成本高效酶法合成RM提供技术支持。

图1 体外多酶级联反应体系示意图Fig.1 Process of multiple-enzyme cascade reactionsystem in vitro

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 目的基因、菌株及质粒

E.coliMatch1T1购自Invirtogen公司；E.coliRosetta（DE3）购自Invirtogen公司；通用载体质粒pET22b购自Takara公司；大肠杆菌表达质粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7、pET22b-EUGT11/4 copies of T7均由本实验室构建。

1.1.2 酶及试剂

Restriction Enzymes FastDigest®购于赛默飞世尔科技公司；PCR高保真酶Prime STAR HS（premix）购自Takara公司；质粒小量提取试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司；酶反应产物纯化试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司；UDP（尿苷二磷酸）及UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）均购自上海源叶公司；氨苄青霉素Amp及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）均购自北京普博欣生物科技有限公司；ST、RA、RD及RM底物及标准品均由曲阜海根甜菊制品有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 目的基因序列合成及扩增

甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1，水稻来源的糖基转移酶EUGT11及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的基因序列均由南京金斯瑞公司优化合成，并分别克隆至载体pUC57，得到pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1三个质粒。

1.2.2 表达载体构建

1.2.2.1UGT76G1、EUGT11和SUS1的单启动子表达载体构建

以质粒pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1为模板，分别用引物UGT76G1-F和UGT76G1-R、EUGT11-F和EUGT11-R、SUS1-F和SUS1-R（表1），将目的片段扩增，将大小正确的PCR产物并回收备用。用XhoⅠ和NdeⅠ酶切载体pET22b并纯化，将纯化后的载体分别和目的基因片段连接。将10 μL连接产物分别转化至E. coliMatch1T1，涂布于含有氨苄霉素的LB平板。挑取阳性转化子扩大培养后提质粒，经酶切验证正确后，送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，得到测序正确的质粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1，并将对应菌株于甘油中低温保藏。

表1 用于载体构建的寡核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides for plasmids construction

图2 糖基转移酶EUGT11表达载体Fig.2 Plasmids used for expression of UDP-glucosyltransferase EUGT11

1.2.2.2EUGT11多重启动子表达载体构建

以质粒pET22b-EUGT11为模板，用pET22b-F和pET22b-R扩增得到含有和目的基因EUGT11的pET22b载体骨架的大片段，命名为pET22b-scaffold-EUGT11，胶回收备用。将2 copies of T7-F和2 copies of T7-R（表1）两条寡核苷酸链在98 ℃条件下变性5 min，自然降至室温完成退火，形成双启动子双链片段，命名为2 copies of T7，回收该片段备用。将另外两对寡核苷酸链3 copies of T7-F和3 copies of T7-R、4 copies of T7-F和4copies of T7-R（表1）也进行如上操作，分别退火形成三重启动子和四重启动子双链片段，分别命名为3 copies of T7和4 copies of T7。将双链片段2 copies of T7、3 copies of T7和4 copies of T7分别与pET22b-scaffold-EUGT11连接，转化至大肠杆菌E. coliMatch1T1。经带有氨苄霉素的抗性平板初步筛选阳性转化子，将鉴定正确的转化子送至广州天一辉远基因科技有限公司测序。得到含有双重、三重、四重启动子的EUGT11表达质粒，分别命名为pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7（图2）。

1.2.3 大肠杆菌诱导表达

将质粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7分别转化至Rosetta（DE3），经氨苄霉素抗性LB平板筛选阳性转化子，分别命名为Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1、Rosetta-EUGT11/2 copies of T7、Rosetta-EUGT11/3 copies of T7和Rosetta-EUGT11/4 copies of T7。将以上重组大肠杆菌分别于液体LB中培养8 h，以1%接种量转接于100 mL新鲜LB液体培养基，待菌体生长至OD600=0.7左右，向其中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至工作浓度为0.5 mmol/L，并在20 ℃，200 r/min条件下低温诱导培养。诱导20 h后，以4 ℃，8000 r/min离心收集菌体，30 mL超纯水洗涤两次，最后用10 mL 50 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎30 min，离心取上清液得到粗酶液，用于后续BCA法蛋白浓度测定及酶活测定。

1.2.4 酶活测定

1.2.4.1 酶活测定体系

糖基转移酶UGT76G1酶活测定体系：将Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200 μL。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的总蛋白量为2 mg。反应30 min后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对UDP、UDPG进行定性定量分析。

糖基转移酶EUGT11酶活测定体系：将Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200 μL。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液，1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的总蛋白量为2 mg。反应30 min后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对UDP、UDPG进行定性定量分析。

蔗糖合成酶SUS1酶活测定体系：将Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200 μL。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、700 mmol/L蔗糖、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的总蛋白量为2 mg。反应30 min后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对UDP、UDPG进行定性定量分析。

1.2.4.2 酶活计算公式

酶活力单位定义为：各酶在相应反应条件下，每1 min生成1 mmol/L UDPG或UDP所需酶量。

式中：

C——通过标准曲线计算出的UDP、UDPG浓度，mmol/L；

N——稀释倍数；

V——反应体系体积，L；

T——反应时间，min；

m——反应体系中的蛋白含量，g。

1.2.5 重组酶UGT76G1和EUGT11对糖苷类底物转化率测定

重组酶UGT76G1对底物转化率测定体系：将Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200 μL。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量为10 mU。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活,超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对ST、RA或RD、RM进行定性定量分析，并计算ST或RD的转化率。

重组酶EUGT11对底物转化率测定体系：将Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液与反应体系混合，总体系为200 μL。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量为10 mU。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对RA、RD进行定性定量分析，并计算RA的转化率。

1.2.6 体外单级联体系和体外多酶级联体系产物测定

1.2.6.1 重组酶UGT76G1和SUS1参与的体外单级联体系中ST转化率测定

按照1.2.3的方法破碎获得Rosetta-UGT76G1和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制体系中SUS1酶量为10 mU，UGT76G1酶量分别为10 mU、20 mU、30 mU，使得反应体系中双酶酶量比例为1:1、1:2、1:3。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L ST、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，补加蒸馏水至200 μL。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对ST、RA进行定性定量分析，并计算ST转化率。

1.2.6.2 重组酶EUGT11和SUS1参与的体外单级联体系中RA转化率测定

按照1.2.3的方法破碎获得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反应体系中SUS1酶活力为10 mU（换算成总蛋白质量为0.16 mg），EUGT11酶活力分别为10 mU、20 mU、30 mU（换算成蛋白质量分别为1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg），使得反应体系中双酶酶活力比例为1:1、1:2、1:3（换算成蛋白质量比为1:12.3、1:24.6、1:36.9）。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，补加蒸馏水至200 μL。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对RA、RD进行定性定量分析，并计算各酶量配比下的RA转化率。

破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也加入到同样体系反应，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量为：保证反应体系中所含该粗酶液的蛋白质量与Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力为10 mU、20 mU、30 mU时对应的蛋白质量一致，即分别为1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg，具体为：使反应体系中SUS1酶活力为10 mU（换算成总蛋白质量为0.16 mg），Rosetta-EUGT11/3 copies of T7酶活力分别为21.3 mU、42.6 mU、63.9 mU，使得反应体系中双酶酶活力比例为1:2.13、1:4.26、1:6.39。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对RA、RD进行定性定量分析，并计算各酶量配比下的RA转化率。

1.2.6.3 重组酶UGT76G1和SUS1参与的体外单级联体系中RD转化率测定

按照1.2.3的方法破碎获得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制体系中SUS1酶量为10 mU，UGT76G1酶量分别为10 mU、20 mU、30 mU，使得反应体系中双酶酶量比例为1:1、1:2、1:3。其中各组份及终浓度为50 mmol/L pH 7.0磷酸钾缓冲液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/LRD、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，补加蒸馏水至200 μL。反应24 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC对RD、RM进行定性定量分析，并计算RD转化率。

1.2.6.4 重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1参与的体外多酶级联体系产物测定

按照1.2.3的方法破碎获得Rosetta-SUS1，Rosetta-UGT76G1和Rosetta-EUGT11的粗酶液，以酶活力比例为1:2:3加入反应体系中，即各酶酶活力分别为10 mU、20 mU、30 mU。其中各组份及终浓度为50 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0）、700 mmol/L蔗糖、10 mmol/L ST、20 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，补加蒸馏水至200 μL。反应48 h后，95 ℃加热5 min使酶失活，超纯水稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤后，经HPLC分析对ST、RA、RD、RM进行定性定量分析。破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也按照同样体系反应，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量为：保证反应体系中所含该粗酶液的蛋白质量与Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力为30 mU对应的蛋白质量一致，即为5.9 mg。

1.2.6.5 底物转化率计算公式

式中：

St0——反应结束时底物浓度，mmol/L；

St1——反应开始时底物浓度，mmol/L。

1.2.7 HPLC分析条件

HPLC分析RA、ST、RM、RD条件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色谱系统，Phenomenex Luna 5μ C18柱，流动相为A（1.5 g/L磷酸二氢钠缓冲液）:B（乙腈）=68:32，采用等度洗脱，进样量10 μL，检测波长210 nm。ST、RA、RD、RM标准品经以上条件分析后，得到外标法分析所用的标准曲线。

HPLC分析UDP、UDPG条件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色谱系统，Phenomenex Luna 5μ C18 柱，流动相为A（200 mmol/L磷酸盐缓冲液）：B（1.62 g/L四丁基溴化铵水溶液）=1:1，采用等度洗脱，进样量10 μL，检测波长262 nm。UDPG、UDP标准品经以上条件分析后，得到外标法分析所用的标准曲线。

1.2.8 数据处理

每个重组大肠杆菌重复发酵三次，每个蛋白浓度测定体系、酶活测定体系以及级联反应体系均设置三个平行，数据值为平行样品的平均值，用误差线表示标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 重组酶UGT76G1、EUGT11、SUS1的表达研究

2.1.1 重组酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表达载体构建

为了构建重组酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表达载体，将目的基因UGT76G1、EUGT11、SUS1分别与线性化的pET22b载体连接，并对表达载体pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1进行琼脂糖凝胶电泳及酶切鉴定。质粒的琼脂糖凝胶电泳出现大小为6717 bp、6747 bp、7767 bp的条带（图3），与各质粒大小一致。用XbaⅠ和NdeⅠ对质粒pET22b-UGT76G1双酶切鉴定，用XbaⅠ和ClaⅠ对质粒pET22b-EUGT11双酶切鉴定，释放出的片段大小分别为5303 bp和1414 bp、5357 bp和1390 bp，条带大小正确；用XbaⅠ对质粒pET22b-SUS1单酶切鉴定，得到大小为7767 bp的单一条带，大小正确（图3）。由 于 质 粒pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7大小差距不大，只能依靠测序手段鉴定是否有相应个数的启动子与载体连接，正确连接的载体如图2。

图3 质粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1及酶切鉴定电泳图Fig.3 Electropherogram of pET22b-UGT76G1, pET22b-EUGT11, pET22b-SUS1and their restriction enzymedigestion

2.1.2 重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1表达活性研究

分别对重组菌Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液进行酶活测定，以探究重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1在大肠杆菌胞内表达情况。糖基转移酶UGT76G1，EUGT11催化UDPG转化为UDP，故按照反应生成UDP的量计算酶活；SUS1催化UDP转化为UDPG，按照反应生成UDPG的量计算酶活。结果如表2，UGT76G1（ST）、UGT76G1（RD）、EUGT11、SUS1酶活分别为31.35、19.27、5.09、65.34 U/g，宿主Rosetta（DE3）粗酶液基本无活性，表明重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1均已在大肠杆菌胞内成功表达。

其中，重组酶UGT76G1催化不同糖基转移反应时，UDPG转化率差异较大（表2，图4c、4d），催化ST转化为RA的酶活为催化RD转化为RM酶活的1.63倍，可能是ST的分子构型相较于RD更易进入该酶的催化口袋而更快的触发糖基转移反应[12]，此时该酶对于糖基供体UDPG的葡萄糖基移除速率也更快，表现为该酶催化ST转化为RA时也有更高的UDPG转化率。重组酶EUGT11的酶活最低，反应结束只有少量UDP产生（图4e），可初步认为在体外多酶级联催化体系中，EUGT11是该体系的限速酶。重组酶SUS1的UDP转化率最高，反应结束后UDP几乎完全转化为UDPG（图4b），较高的酶活使得该酶能在体外多酶级联反应体系中为糖基转移反应提供足量糖基供体UDPG。

表2 重组大肠杆菌粗酶液酶活测定Table 2 Enzyme activity of crude lysates

图4 UDP、UDPG的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of UDP, UDPG

2.2 重组酶UGT76G1和EUGT11对糖苷类底物转化率研究

表3 重组酶UGT76G1和EUGT11粗酶液对底物的转化率测定Table 3 Conversion rate of different substrates of UGT76G1 and EUGT11 crude lysates

为了确定体外多酶级联反应体系中的限速酶，比较了在相同酶量下糖基转移酶UGT76G1对ST和RD转化率以及EUGT11对RA的转化率。结果如表3，Rosetta-UGT76G1粗酶液对ST的转化率为98.92%，对RD的转化率为57.49%，Rosetta-EUGT11粗酶液对RA的转化率仅为13.25%。由此可知，重组酶UGT76G1几乎可以将ST完全转化为RA，保证多酶级联反应体系第一步反应的催化效率。重组酶EUGT11对RA的转化率较低，导致RD产量低，不能为RM的合成提供足量的前体，故该步骤应为体外多酶级联反应体系中的限速步骤。

2.3 在不同串联个数启动子操控下表达的重组酶EUGT11酶活比较

启动子是转录调控的起始位点，启动子与RNA聚合酶结合并起始转录，该过程直接影响到下游基因的转录水平。理论上多拷贝的启动子可以增加DNA分子与聚合酶的作用的机率，即可以通过增加启动子拷贝数，提高下游基因的转录效率，从而增加目的基因表达量而提高酶活力[13]。王俊姝[14]在大肠杆菌中，通过将化学合成五个重复trc启动子核心区与载体连接，并以绿色荧光蛋白和半乳糖苷酶作为信号分子监测启动子的启动强度，证明其启动强度是单拷贝启动子强度的3.47倍，该结果为本实验在提高限速酶酶活方面提供了基本思路。为提升限速酶EUGT11活性，从而提升体外多酶级联反应体系的整体催化效率，本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联，分别构建含有一重、二重、三重和四重启动子的EUGT11表达质粒的重组大肠杆菌，并测定酶活，结果如表4，在相同反应条件下，重组酶EUGT11、EUGT11/2 copies of T7、EUGT11/3 copies of T7、EUGT11/4 copies of T7酶活分别为5.09、0.29、10.84、9.21 U/g。相比单启动子控制下表达的重组酶EUGT11，三重启动子将酶活提升2.13倍。四重启动子也使得酶活提升1.81倍，而二重启动子使得该酶的表达量大幅下降，酶活仅为0.29 U/g。

表4 不同串联个数启动子操控下表达的EUGT11酶活Table 4 Comparison of enzyme activity of EUGT11 with different number of promoters

2.4 体外各单级联反应最佳酶量配比探究

为便于确定体外多酶级联反应体系的酶量配比，先对各单级联反应的最佳酶量配比进行探究。本文控制重组酶SUS1与重组酶UGT76G1的单酶级联反应中的酶活力配比为1:1、1:2、1:3。由于多重启动子中，三重启动子对重组酶EUGT11酶活提升效果最佳，故选择重组菌Rosetta-EUGT11/3 copies of T7破碎液进行以RA为底物的单酶级联反应最佳酶量配比探究，并以重组菌Rosetta-EUGT11破碎液做为对照，本文控制重组酶SUS1与重组酶EUGT11或重组酶EUGT11/3 copies of T7的单酶级联反应中蛋白质量配比为1:2.3、1:24.6、1:36.9。比较三种酶活力或蛋白质量配比下各糖基转移酶对底物的转化率，转化率最高时的酶活力或蛋白质量配比为该单级联反应的最佳酶活力或蛋白质量配比，结果如图5。

重组酶EUGT11和EUGT11/3 copies of T7催化RA转化为RD的单级联反应情况如图5a和5b，SUS1与EUGT11的酶活力配比为1:1、1:2、1:3时，RA的转化率分别为19.07%、29.10%、36.56%；SUS1与EUGT11/3 copies of T7的酶活力配比为1:2.13、1:4.26、1:6.39时，RA的转化率分别为25.68%、63.60%、79.75%。由此可知，单启动子控制下的EUGT11和三重启动子控制下的EUGT11在酶量配比为1:3和1:6.39时（即蛋白质量配比均为1:36.9时）出现RA最高转化率，且后者最高转化率为前者的2.18倍。

重组酶UGT76G1催化ST转化为RA的单级联反应结果如图5c，SUS1与UGT76G1的酶量配比为1:1、1:2、1:3时，ST转化率分别为89.17%、95.28%、87.89%。当酶量配比为1:2时，ST转化率最高，再增加糖基转移酶的量至酶量配比为1:3时，产物RA转化率略有降低。

图5 单级联反应中SUS1和UDP糖基转移酶不同酶量配对应的底物转化率Fig.5 Substrate conversion rate with different ratios of SUS1 and UDP-glucosyltransferase in cascade reaction

重组酶UGT76G1催化RD转化为RM的单级联反应结果如图5d，SUS1与UGT76G1的酶量配比为1:1、1:2、1:3时，RD转化率分别为89.57%、99.26%、35.92%。当酶量配比为1:2时RD转化率最高，再增加UGT76G1至酶量配比为1:3时RD转化率大幅降低。可能由于酶量配比为1:2时，该级联反应中SUS1的糖基供体UDPG供应速度与UGT76G1转糖基速度达到最优平衡，若再增加糖基转移酶的量，使UDPG消耗量加大，在SUS1酶量不变的情况下，UDPG的产生速度跟不上消耗速度，可能会在一定程度上破坏偶联反应的平衡，使RD的转化率降低。

将每个单酶级联反应体系的最佳酶活力配比综合，则体外多酶级联反应体系最佳酶活力配比应为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39，换算成蛋白质量比例为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:4:36.9。

2.5 三重启动子操控下表达的EUGT11对体外多酶级联反应体系中RM产量探究

图6 体外多酶级联反应体系HPLC产物分析Fig.6 HPLC analysis of production in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

表5 不同体外多酶级联反应体系RA、RD、RM浓度比较Table 5 Comparison of concentration of RA, RD and RM in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

为了研究EUGT11的表达效率对体外多酶级联反应体系终产物RM产量的影响，将单启动子操控下表达的EUGT11参与的反应体系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3（对照组）与三重启动子操控下表达的EUGT11参与的反应体系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39（实验组）在相同条件下反应48 h后，用HPLC对反应后各体系中的ST、RA、RD、RM进行定量分析，结果如图6和表5所示。反应进行48 h后，在体系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3中，10 mmol/L ST转化为7.85 mmol/L RA，2.29 mmol/L RD和1.61 mmol/L RM；在体系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39中，10 mmol/L ST转化为3.14 mmol/L RA，5.76 mmol/L RD和3.79 mmol/L RM（表5）。在两个体系中，ST均完全转化为RA，而在三重启动子控制下的EUGT11参与的体系中，由于RA转化率提升，使得RD和RM产量均高于单重启动子控制下的EUGT11参与的反应体系（图6）。相比单重启动子控制下的EUGT11参与的反应体系，三重启动子控制下的EUGT11使得反应结束时RD产量提升2.52倍，RM产量也随之提升2.35倍。

3 讨论

UGT76G1和EUGT11是目前甜菊醇糖苷类物质酶法生产中较常使用的糖基转移酶，但多数生产方法仅利用单个酶与蔗糖合成酶偶联产生单一种类的糖苷，且产物大多为RA或RD。朱清娟[15]利用重组毕赤酵母制备的粗酶液，在体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶，将10 mmol/L ST转化合成8.20 mmol/L RA。杨玉凤[16]利用重组大肠杆菌全细胞催化1 mmol/L RA转化为0.1 mmol/L RD。而本文利用大肠杆菌表达的重组酶UGT76G1、EUGT11和SUS1搭建体外反应通路，使廉价底物ST先经UGT76G1催化为RA，再经EUGT11催化产生RD，最后经UGT76G1转化为RM，该体外反应通路旨在利用较简单的生产方法得到更高品质的甜味剂RM。

4 结论

3.1 本文通过比较重组酶UGT76G1对ST和RD的转化率以及EUGT11对RA的转化率，得知EUGT11对底物RA的转化率最低，仅13.25%，而该酶参与的糖基转移反应正是产生RM的前体RD的关键一步，因此，提升该酶酶活是提升终产物RM产量的关键。为提升该限速酶酶活，构建了三重启动子操控下表达的重组酶EUGT11，相比单启动子操控下表达的重组酶EUGT11，三重启动子使其酶活提升2.13倍。当三重启动子操控下表达的重组酶EUGT11参与整个体外多酶级联反应体系时，RD产量提升2.52倍，RM产量也随之提升2.35倍，该反应体系将10 mmol/L ST转化为3.79 mmol/L RM。

3.2 本文提供的RM合成方法与直接催化RD生产RM的方法相比，底物廉价，催化效率较高，为此后RM生物合成的工业应用提供新思路。但该一锅法催化所得产物成分较复杂，含有多种糖苷类物质，RM不易从众多性质相似的成分中分离。为得到纯度更高的RM，可以继续挖掘更优质的糖基转移酶基因，或用异源表达量大且本底表达量低的宿主进行糖基转移酶和蔗糖合成酶的异源表达，旨在获得纯度更高的RM。