甲基烯丙基三硫醚对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子 及肠道菌群的调节作用

吴苹，刘晋倩，王硕，董晶，范宗强，李震，陈芳

（聊城大学药学院，山东聊城 252059）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种炎症性肠病，主要在结肠的远端靠近直肠的部位发病，通过在肠黏膜和粘膜下层形成溃疡面而产生连续性炎症反应[1]。这种病的临床症状主要表现为严重的腹痛、腹泻和便血。自21世纪以来，该病的发病率在全球范围内不断呈上升趋势[2]。溃疡性结肠炎的发病机制目前还不清楚，研究表明其发病病因与遗传、环境、免疫[3,4]以及肠道菌群有关。目前，该病主要以抗炎和免疫调节为主，以生物制剂治疗为辅。治疗的药物能有效缓解疾病症状，但同时也伴有许多副作用。因此，从天然资源中开发创新有效的药物对减少副作用和改善治疗效果尤为重要。

大蒜是一种药食同源的植物，可入脾、胃、肺经，具有抗菌、消炎等多重功效，在中医应用上历史悠久。研究发现大蒜中的提取物，如大蒜素、大蒜多糖、二烯丙基二硫醚（DADS）、二烯丙基三硫醚（DATS）、甲基烯丙基二硫醚（AMDS）和甲基烯丙基三硫醚（AMTS）等，具有抗炎抗氧化的作用，可被用于预防或治疗炎症性疾病。例如徐兴华等[5]研究表明大蒜素对溃疡性结肠炎小鼠有治疗作用，其作用机制可能是通过抑制TNF-α和MPO的水平，阻断炎症的放大效应。Wang等[6]研究发现大蒜多糖可通过增加毛螺菌和乳酸菌的丰度以及降低费克蓝姆菌属和壁厚菌门的丰度来发挥调节肠道菌群的作用，达到治疗效果。Lee等[7]研究发现大蒜有机硫提取物DATS可通过抑制NF-кB/STAT3信号通路缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。Zhang等[8]研究表明AMDS通过NF-кB信号通路抑制肠上皮细胞中IL-8和IP-10的分泌，对肠道炎症具有改善作用。而对于提取物AMTS的研究，Zhao等[9]研究发现它对乙酰氨基酚诱导的肝毒性具有保护作用，但是该提取物对溃疡性结肠炎的作用机制尚不清楚。因此，本研究以AMTS为实验对象，探索其对溃疡性结肠炎的影响及作用机制，研究其调节肠道菌群多样性和提高肠道免疫系统的关系，为开发具有抗溃疡性结肠炎的药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AMTS（CAS号：34135-85-8）购自湖北信康医药化工有限公司；TNF-α试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒，武汉云克隆科技股份有限公司；苏木精伊红（HE）染色试剂盒，杭州碧云天公司；乙醇（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

SF-400A型电子称，奥豪斯仪器（上海）有限公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；8S-1型磁力搅拌器，江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；MY-10手持式匀浆仪，上海净信实业发展有限公司；HFU 40400BA型超低温冰箱，美国Thermo公司；5425R型低温离心机，德国eppendorf公司；Synergy H1酶标仪，美国BIOTEK公司。

ICR小鼠，SPF级，体重16～20 g，雄性，购于济南朋悅实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK(鲁)20190003。小鼠在动物房正常饲养，适应环境7 d，自由饮食，19～23 ℃，光暗周期12/12 h。

1.2 实验方法

1.2.1 试验动物分组、建模及给药

将50只小鼠适应性喂养一周后，按平均体重无显著性差异分为5组，每组10只，分别为空白对照组（Control）、模型组（DSS组）、AMTS低剂量组AMTS（L）25 mg/(kg·d)、AMTS中剂量组AMTS（M）50 mg/(kg·d)和AMTS高剂量组AMTS（H）100 mg/(kg·d)，AMTS剂量的选择参照Zhao等[9]方法。除空白组外，其余4组连续自由饮用2%的DSS溶液7 d，建立小鼠溃疡性结肠炎模型。从第8 d开始，AMTS组分别给予低、中、高三个剂量灌胃，空白组和DSS组给予等量玉米油，每日一次，连续灌胃7 d。

1.2.2 标本采集

在末次给药24 h后，对小鼠进行眼球取血，在4 ℃下3000 r/min离心10 min后取上清液，然后将上清液在-80 ℃保存用于生化分析。采血后将小鼠脱颈椎处死，解剖小鼠并收集结肠组织，测量结肠长度后置于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理分析。最后收集小鼠24 h的新鲜粪便。采用拎尾法进行粪便的采集，拎起小鼠的尾巴，通过刺激小鼠，排出粪便。用灭菌的镊子收集每只小鼠的粪便，每收集完一只小鼠的粪便后，用酒精擦拭镊子进行灭菌，继续收集另外一只小鼠的粪便。收集好的粪便放入无菌的EP管，并将EP管立即放入冰盒中，最后放入-80 ℃冰箱保存，用于肠道菌群的检测。

表1 疾病活动指数（DAI）评分标准Table 1 Standard of mice disease activity index (DAI) score

1.2.3 疾病活动指数（DAI）的评估

参照文献[10,11]的方法，对造模后小鼠的体重、粪便黏度和便血等情况进行评分（表1），每天记录一次疾病活动指数(DAI)评分，以评估结肠炎的严重程度。评分的每一项指数均按0～4分进行评分，0分表示无疾病症状，4分表示严重疾病症状。具体标准见表1。

1.2.4 小鼠结肠组织病理学观察

采用苏木精和伊红（HE）染色法分析结肠组织病理变化。对取出的小鼠的结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定，固定24 h后进行乙醇脱水，然后再经乙醇和二甲苯脱水，用石蜡包埋制成蜡块。将蜡块用切片机制备5 μm切片并用HE法染色，最后在光学显微镜下观察结肠组织的病理变化。

1.2.5 炎症因子测定

对小鼠进行眼球取血，在4 ℃下3000 r/min离心10 min后取上清液，然后将上清液在-80 ℃保存用于生化分析。对收集的血清使用酶联免疫吸附法进行炎症因子测定。根据酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明书操作步骤，检测各组小鼠血清中的炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平。

1.2.6 肠道菌群16S rRNA测序及生物信息学分析

结肠炎是由肠道共生菌群或其代谢物侵入肠道屏障，驱动免疫细胞的激活和分化而引发的[12]。根据文献[13,14]报道的16S rRNA检测分析，将收集的小鼠粪便委托微基生物科技节（上海）有限公司进行测序分析，以便确定AMTS对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎肠道菌群的影响。

1.2.7 统计分析

数据用均数±标准差（Mean±SD）表示。所有数据均采用IBM SPSS 24统计软件进行分析。数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey检验进行差异显著性分析。p＜0.05为有统计学意义。图形分析采用Graph Pad Prism 5.0。

2 结果与分析

2.1 AMTS对体重和DAI的影响

溃疡性结肠炎小鼠最典型的症状就是体重下降，如图1a所示，模型组在第9 d开始出现体重下降，平均体重为26.63 g。到了第12 d，模型组小鼠平均体重为22.58 g，空白组平均体重为31.05 g，模型组体重与空白组相比下降显著，具有统计学意义（p＜0.01）。与模型组相比，AMTS干预组在第9 d出现体重下降，但下降缓慢。比较第14 d体重时发现，模型组较第9 d时体重下降25.59%，AMTS低剂量组下降4.06%，AMTS中剂量组下降9.88%，AMTS高剂量组5.45%。AMTS低剂量组体重下降最少，模型组体重下降最多。

疾病活动指数对评估结肠炎的严重程度具有指导意义[10,11]。从图1b可以看到，造模期间模型组DAI评分明显高于空白组。比较最后一天DAI时发现，空白组的DAI值为0，模型组DAI值为3.51，AMTS低剂量组为2.60，AMTS中剂量组为2.88，AMTS高剂量组为2.79。这说明经AMTS灌胃干预后，小鼠DAI评分明显下降，并且与模型组相比具有显著性差异（p＜0.01）。

图1 AMTS对DSS结肠炎小鼠的肠炎症状的影响Fig.1 Effect of AMTS on the symptoms of DSS induced ulcerative colitis in mice

溃疡性结肠炎会导致小鼠肠壁增厚，结肠长度缩短，所以结肠长度也是评价溃疡性结肠炎的一个间接指标[15]。图1c中结果表明，空白组结肠长度为11.07 cm，模型组长度明显收缩，平均长度为7.17 cm，较正常组相比缩短35.23%，两组具有显著性差异（p＜0.01）。AMTS低剂量的结肠长度为8.19 cm，与模型组相比具有显著性差异（p＜0.01）。中剂量组7.89 cm和高剂量组7.8 cm的结肠长度较模型组增加，但差异无显著性。

吴铭等[16]用芸薹属紫菜蔬乙醇提取物对2% DSS诱导的小鼠结肠炎结果表明，与空白组相比，模型小鼠体重显著下降（p＜0.05），DAI指数显著升高（p＜0.05），并且结肠长度较正常组结肠长度缩短61.70%。本实验的上述结果说明DSS诱导的溃疡性结肠炎模型是成功的，AMTS能抑制结肠炎小鼠体重下降，改善腹泻和便血现象，缓解溃疡性结肠炎。

2.2 结肠组织病理学分析

图2 DSS结肠炎小鼠结肠组织切片HE染色(10×)Fig.2 HE staining of intestinal tissue sections of DSS induced ulcerative colitis in mice (10×)

徐敏等[17]在粪便微生物粗提液对3% DSS诱导的小鼠结肠炎的结果中，对结肠组织的HE染色发现，正常小鼠结肠组织隐窝腺、基质和粘膜等上皮结构保存完整，而DSS组小鼠肠组织出现典型的隐窝上皮损毁，粘膜广泛损伤和炎症细胞浸润。在本研究中，如图2所示，空白组小鼠结肠组织的黏膜上皮结构完整清晰，腺体排列整齐，无炎症细胞浸润。模型组小鼠的结肠组织存在隐窝变形、杯状细胞丢失、炎症细胞浸润和严重的黏膜损伤。与模型组相比，AMTS剂量组能减轻隐窝上皮变形、杯状细胞丢失，小鼠黏膜炎症程度明显改善，黏膜病变有所减轻，炎症细胞浸润有所减少，这说明AMTS对DSS所致的结肠炎有保护作用。

2.3 AMTS调节炎症因子的分泌

图3 AMTS对DSS结肠炎小鼠炎症细胞因子的影响Fig.3 Effect of AMTS on the inflammatory factors of DSS induced ulcerative colitis in mice

促炎细胞因子的失调是炎症性肠病（IBD）的一个标志。越来越多的文献[18,19]表明促炎细胞因子在IBD的发病机制中起关键作用。促炎细胞因子水平的升高，例如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等，是结肠炎病症的主要特征。因此下调促炎因子水平对溃疡性结肠炎是一种可行的治疗策略。

在本实验中，结果如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显增加（p＜0.01），分别较正常组小鼠升高3.39倍、1.52倍和3.38倍。与模型组相比，AMTS低剂量、AMTS中剂量组以及AMTS高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低（p＜0.05，p＜0.01），其中TNF-α水平分别降低了40.13%、34.87%和53.95%；IL-1β水平分别降低了39.25%、34.62%和39.10%；IL-6水平分别降低了14.48%、18.34%和21.74%；给药组间差异不明显。这一结果与Kanwal等[20]的研究结果相类似。Kanwal[20]发现竹荪多糖（DIP）可下调结肠炎小鼠中的促炎细胞因子，尤其是高剂量（33 mg/kg）的竹荪多糖，可显著下调IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等炎症因子水平（p＜0.01）。因此，研究结果表明，DSS模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，而使用AMTS处理则可显著降低这些炎症因子的水平。这说明AMTS降低疾病活动指数以及缓解组织病理损伤可能与调节炎症因子水平有关。

2.4 AMTS对结肠炎小鼠肠道菌群的影响

2.4.1 韦恩图

图4 小鼠肠道菌群的韦恩图Fig.4 Venn diagram of different mice microflora

韦恩图可用于统计多个样品中共有和独有的OTU数目，可以比较直观的反映样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。Kanwal等[20]研究了DIP对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群的影响。其中，韦恩图显示空白组粪便的OTU为1418，模型组粪便的OTU数与空白组相比下降33.29%；DIP低剂量组和高剂量组与空白组相比分别下降14.88%和3.81%。本研究采用韦恩图分析各组小鼠菌群OTU的数量及其种类的交叉情况。图4中，五组小鼠粪便中OUT共有385个，核心OTU有65个，占总OTU数的16.88%。各组特异性OTU/总OTU分别为空白组20/180，模型组3/185，AMTS低剂量组12/229，AMTS中剂量组21/258，AMTS高剂量组23/237。空白组与模型组在总的OTU数量上没有差异，但空白组的特异性OTU数量明显高于模型组。AMTS三个剂量组的总OTU数量均高于空白组和模型组，这说明AMTS处理可以增加小鼠肠道菌群的丰富度。

2.4.2 小鼠肠道菌群α多样性分析

图5 α多样性箱线图Fig.5 Boxplot of alpha diversity

本研究采用α多样性分析来比较不同分组的小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。α多样性分析包括chao指数、ace指数，shannon指数以及simpson指数等。chao指数和ace指数反映样品中群落的丰富度，可直观地反映群落中物种的数量。shannon指数以及simpson指数反映群落的多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响。chao指数、ace指数、shannon指数越大，simpson指数越小，则说明样品中的物种越丰富。如图5所示，与空白组相比，模型组的chao指数、ace指数、shannon指数均降低，simpson指数升高。经25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg AMTS处理的小鼠肠道菌群，其chao指数、ace指数、shannon指数均高于模型组，simpson指数低于模型组，这说明AMTS可以提高小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。

有研究表明[20]用DIP处理结肠炎小鼠14 d后，DIP组不仅会增加小鼠肠道菌群的丰富度，而且还增加了多样性。分析本实验结果可以发现，小鼠饮用DSS溶液后降低了肠道菌群的多样性和丰富度，而AMTS同样可以改善肠道菌群的丰富度，增加多样性。

把试卷中三种题型实际难度做为自变量(第一大题为x1，第二大题为x2，第三大题为x3)，整卷的实际难度做为因变量y，通过标准化转化，然后建立多元回归分析模型，基于表1数据可以得到三个自变量的回归系数(P值)为0.331(P<0.001)、0.239(P<0.001)和0.62(P<0.001).

2.4.3 小鼠肠道菌群β多样性分析

群落结构组成柱状图是根据分类学分析结果，得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况。从群落结构组成柱状图中可以分析样品中的微生物种类及各种微生物的相对丰度。

图6a是样品在门水平上的各组肠道菌群的群落结构。空白组菌群反映正常小鼠肠道菌群的构成，可以看出，在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻门（Cyanobacteria）是主要物种。与空白组相比，模型组在门水平上，Firmicutes、脱 铁 杆 菌 门（Deferribacteres）、Cyanobacteria的比例显著升高，Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria明显减少。有研究报道Bacteroidetes是促进结肠炎发生发展的主要因素之一，Chen等[21]已经证实Bacteroidetes的失调与IBD有关。在本研究中可以看到，与空白组相比，Bacteroidetes的相对丰度在DSS诱导的小鼠结肠炎中升高，而AMTS低剂量和高剂量能显著降低Bacteroidetes的相对丰度，说明我们的研究结果和文献报道具有一致性。

图6b显示，在属水平上，除去未确定分类的肠道菌，在空白组中Bacteroidetes、另枝菌属（Alistipes）、拟 普 雷 沃 菌 属（Alloprevotella）、乳 酸 杆 菌（Lactobacillus）、臭味菌属（Odoribacter）、埃希氏菌（Escherichia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）是主要菌属。与空白组相比，模型组中的Bacteroidetes、Alistipes、Alloprevotella、Odoribacter较空白组有增加趋势，而Lactobacillus、Escherichia有减少趋势。图6b可以看到，与模型组相比，AMTS低剂量和高剂量组下调了Alistipes的丰度，同时高剂量组还降低了Odoribacter的丰度。陈燕等[22]研究发现短链脂肪酸的浓度与肠道菌群密切相关，其中乙酸、丙酸与丁酸在肠道中是主要的短链脂肪酸。Alistipes及Odoribacter是有害菌，其丰度与乙酸存在显著负相关，会导致短链脂肪酸代谢异常，促进炎症的发生。本研究中，AMTS降低了有害菌Alistipes及Odoribacter的增殖，与以上结果一致。

图6 物种分布柱状图Fig.6 Histogram of horizontal species

图6b还显示，模型组的Lactobacillus、幽门螺杆菌（Helicobacter）丰度明显低于空白组。AMTS低剂量和中剂量较模型组Lactobacillus的丰度有增加趋势，中剂量组的Helicobacter较模型组也明显增加。研究证明Lactobacillus是一种益生菌，能通过阻止致病菌的定植与粘附形成抗菌生物屏障，调节肠道菌群平衡[23]。因此用AMTS干预处理后会提高结肠炎小鼠Lactobacillus的丰度。近几年研究发现[24]Helicobacter感染与IBD呈负相关，Li等[25]在研究中发现，幽门螺杆菌感染可能通过调节中性粒细胞活化蛋白，促进抗炎因子IL-10的产生，从而减轻结肠炎症状。

2.4.4 基于物种信息的Bray-Curtis距离分析

Bray-Curtis距离是反映两个群落之间差异性的常用指标。本研究基于物种信息的Bray-Curtis距离分析，用来比较各样品间基于群落组成的层次聚类，样品之间的距离越远说明差异越大。Cui等[26]在研究黄连素通过调节结肠内肠道菌群治疗溃疡性结肠炎中发现，肠道菌群的系统聚类树空白组和黄连素组相距较近，和模型组相距较远。在本研究中，从图7a可见，在门水平上，空白组和AMTS中剂量组的Bray-Curtis距离最近，其次是AMTS低剂量和高剂量的距离较近，模型组距离最远。在属水平上（图7b），AMTS低剂量和高剂量组样本相距较近，而空白组与模型组、AMTS干预组相距较远。上述结果提示，在门水平上AMTS组的肠道菌群与空白组具有一定的相似性，而与模型组差异明显。在属水平上，模型组和AMTS干预组样本间多样性差异较小，而空白组与模型组、AMTS干预组样本间多样性差异较大。

图7 物种水平样品聚类树与柱状图组合分析图Fig.7 Histogram of horizontal species

3 结论

本研究初步证实了AMTS对溃疡性结肠炎的保护作用与炎症因子水平和肠道菌群的结构密切相关。在该研究中，我们首次发现了AMTS对小鼠溃疡性结肠炎的作用，并揭示了AMTS改善肠道损伤、调节细胞因子水平以及恢复肠道菌群结构的可能机制。研究表明，AMTS作为一种潜在的治疗结肠炎天然产物，可进行大量深入的研究，以便为开发相关药物提供理论依据。