远志皂苷与莲心碱对七氟烷诱发新生大鼠急性和远期认知功能损伤的改善作用及机制分析

韩丽丽，王惠霞，兰新昂，韩慧梅，孙洪超

中国人民解放军联勤保障部队第九六〇医院麻醉科，济南250031

基于儿科手术发展的需求，越来越多的患儿在全身麻醉下接受手术治疗，但全身麻醉对大脑认知功能的影响尚不明确[1]。七氟烷是一种新型吸入性麻醉药物，其具有对气道刺激小、麻醉深度易于调节以及对循环系统影响较小等优点，是一种理想的诱导全麻的吸入性麻醉药物[2]。但诸多研究[3−5]亦指出，七氟烷对神经系统发育具有一定的毒副作用。有临床报道指出，尽管肌肉松弛剂能够促进气管插管，但在较低浓度七氟烷下进行插管，可能会激活交感神经系统，致使血流动力学不稳定[6]。而七氟烷对婴幼儿神经系统的影响尚未可知，故探究应用七氟烷对婴幼儿进行全身麻醉对其神经系统发育的影响至关重要。

中药远志最早记载于《神农本草经》，可安神益智、交通心肾，远志皂苷提取自远志根部，是一种三萜皂苷类化合物[7]。莲心碱为提取自中药莲子心的一种双苄基异哇琳单醚键型生物碱，具有抗炎、抗氧化以及抗抑郁等功效[8]。已有研究[9−10]显示，远志皂苷与莲心碱在治疗老年痴呆等神经系统疾病方面效果显著。本研究旨在分析远志皂苷与莲心碱对七氟烷诱发新生急性和远期认知功能的影响，并探究其可能的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物清洁级别新生Sprague Dawley（SD）大鼠36只，出生4~6 d，雌雄不限定，体重8~18 g，由广州佛尔博生物科技有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK（粤）：20180006。

1.1.2 药品、试剂与仪器远志皂苷（上海颈马生物科技有限公司）；莲心碱（南京景竹生物科技有限公司）；七氟烷（江苏恒瑞制药有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；辣根过氧化酶标记二抗（浙江联科生物有限公司）；Bcl2、Bax多克隆抗体（美国CST公司）；Caspase-3多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；ECL化学发光检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；氧气检测仪（杭州立华仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组将36只新生SD大鼠随机分为中药组、模型组和空白组，每组12只。将中药组、模型组暴露于自制的2.5%七氟烷麻醉箱环境中，2 h·d−1，共3 d；空白组暴露在不含七氟烷的相同麻醉箱环境中，中药组于每次麻醉前30 min腹腔注射远志皂苷与莲心碱1:1配伍溶液（30 mg·kg−1），模型组和空白组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，同时监测氧浓度和七氟烷浓度，维持氧浓度为30%，氧流量为1.5 L·min−1。待新生SD大鼠完全苏醒后，放回母鼠身边饲养，饲养条件为：控制温度在24~26℃，控制照明12 h光照和12 h黑暗，同时予以充足食物和水。

1.2.2 样本收集和处理最后一次麻醉后，采用动脉血气针穿刺各组大鼠左心室，取血，用于检测血气指标；大鼠出生60 d时，进行水迷宫测试实验；大鼠出生70 d时，断头取血，用于检测血清皮质酮含量；并取大鼠海马组织标本，用于WB检测。

1.2.3 血气指标检测最后一次麻醉后，收集各组SD大鼠左心室血清标本3 mL，采用血气分析仪检测各组血气指标动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）以及pH。

1.2.4 皮质脑电图监测从开始麻醉时，采用小动物生命体征监测仪对各组皮质脑电图进行监测，并记录新生SD大鼠皮质脑电图癫痫波总时长、癫痫波平均时长以及癫痫波数量。

1.2.5 Morris水迷宫测试实验大鼠出生60 d时，进行水迷宫测试实验。将直径120 cm、高50 cm的黑色圆柱形水池作为水迷宫，在距离池壁30 cm的水下1.5 cm处放置一个直径10 cm的平台，水温控制为22~26℃，将迷宫划分为4个象限，以监测大鼠运动情况。①定位航行实验：将大鼠沿任意一个象限池壁放入水中，记录大鼠游泳速度和2 min内找到平台的时间（逃避潜伏期），每天4次，每次间隔30 min，共4 d。②空间探索实验：第5天时撤掉平台，将大鼠从距离平台最远的象限放入水池中，记录其60 s内穿越平台次数和目标象限停留时间，并记录其探索时间（2 min内原平台停留时间）。

1.2.6 血清皮质酮含量检测以上实验全部完成后，将各组SD大鼠断头处死，收集血清标本3 mL，采用ELISA法检测血清皮质酮含量。

1.2.7 海 马Bcl2、Bax和Caspase-3表 达采 用Western blot法检测新生SD大鼠海马Bcl2、Bax和Caspase-3表达水平，步骤如下：①收集断头处死的SD大鼠海马组织标本，提取总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度，计算各样品蛋白上样量；②取适量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，先在55 V恒压下电泳30 min，待Marker条带进入分离胶后，调整电压为105 V，继续电泳1~2 h，待电泳条带到达底部绿色线位置时，结束电泳；③电泳完成后，将分离胶转移至PVDF膜，并夹好电转夹放入电转盒中，100 mA电转1.5 h，并采用TBST溶液将PVDF膜清洗干净；④将清洗干净的PVDF膜放进装有5%脱脂奶粉配制而成的封闭液中，室温封闭1~2 h；⑤再次采用TBST溶液将PVDF膜清洗干净，置于Bcl2（1:1 000）、Bax（1:1 000）、Caspase-3（1:1 000）、GADPH（1:1 000）一抗稀释液中孵育，并置于4℃冰箱过夜；⑤采用TBST溶液洗膜，重复3次，并置于辣根过氧化酶标记的二抗稀释液中，室温孵育1~2 h；⑥采用TBST溶液洗膜，重复3次，将膜放入新鲜配制的ECL化学发光显影液中，将膜置于凝胶成像系统中，滴加检测液曝光显影，拍照，计算各样品条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0分析处理数据，数据满足正态分布和方差齐性检验，计量资料全部以均数±标准差（-x±s）描述，多组组间均数对比采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组新生SD大鼠血气指标比较

中药组、模型组和空白组新生SD大鼠PaO2、PaCO2以及pH比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示缺氧和二氧化碳潴留对大鼠脑神经元发育影响不显著(表1)。

表1 各组新生SD大鼠血气指标比较（-x±s，n=12）Table 1 Comparison of blood gas indicators of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表1 各组新生SD大鼠血气指标比较（-x±s，n=12）Table 1 Comparison of blood gas indicators of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

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2.2 各组新生SD大鼠皮质脑电图结果比较

模型组新生SD大鼠皮质脑电图癫痫波总时长、癫痫波平均时长以及癫痫波数量显著高于空白组（P<0.05），中药组显著低于模型组（P<0.05）。提示七氟烷诱导可损伤新生大鼠脑功能，予以远志皂苷与莲心碱干预则对七氟烷诱导的新生大鼠具有一定的脑保护作用（表2）。

表2 各组新生SD大鼠皮质脑电图结果比较（-x±s，n=12）Table 2 Comparison of cortical electroencephalogram results of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表2 各组新生SD大鼠皮质脑电图结果比较（-x±s，n=12）Table 2 Comparison of cortical electroencephalogram results of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—与空白组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义；#—与模型组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义。

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2.3 各组新生SD大鼠Morris水迷宫行为比较

定位航行实验结果（表3）显示，中药组、模型组和空白组新生SD大鼠游泳速度比较差异无统计学意义（P>0.05），模型组新生SD大鼠逃避潜伏期显著长于空白组（P<0.05），中药组显著短于模型组（P<0.05）。空间探索实验结果（表4）显示，中药组、模型组和空白组新生SD大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间比较差异均无统计学意义（P>0.05），模型组新生SD大鼠探索时间显著短于空白组（P<0.05），中药组显著长于模型组（P<0.05）。提示七氟烷诱导后新生大鼠获取空间信息的能力和记忆储存能力明显降低，但予以远志皂苷与莲心碱干预后得到明显恢复。

表3 各组新生SD大鼠定位航行实验结果比较（-x±s，n=12）Table 3 Comparison of results of positioning navigation experiment of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表3 各组新生SD大鼠定位航行实验结果比较（-x±s，n=12）Table 3 Comparison of results of positioning navigation experiment of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—与空白组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义；#—与模型组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义。

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表4 各组新生SD大鼠空间探索实验结果比较（-x±s，n=12）Table 4 Comparison of results of spatial probe test of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表4 各组新生SD大鼠空间探索实验结果比较（-x±s，n=12）Table 4 Comparison of results of spatial probe test of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—与空白组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义；#—与模型组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义。

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2.4 各组新生SD大鼠血清皮质酮含量比较

模型组新生SD大鼠血清皮质酮含量显著高于空白组（P<0.05），中药组显著低于模型组（P<0.05）。提示远志皂苷与莲心碱干预对七氟烷诱导的新生大鼠脑神经发挥保护作用（表5）。

表5 各组新生SD大鼠血清皮质酮含量比较（±s，n=12）Table 5 Comparison of serum corticosterone content of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表5 各组新生SD大鼠血清皮质酮含量比较（±s，n=12）Table 5 Comparison of serum corticosterone content of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—与空白组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义；#—与模型组相比，差异在P<0.05水平下有统计学意义。

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2.5 各组新生SD大鼠海马Bcl2、Bax和Caspase3表达水平比较

模型组新生SD大鼠海马Bcl2/Bax蛋白表达水平显著低于空白组（P<0.05），cleaved Caspase-3表达水平显著高于空白组（P<0.05）；中药组Bcl2/Bax表达水平显著高于模型组（P<0.05），cleaved Caspase-3表达水平显著低于模型组（P<0.05）。提示远志皂苷与莲心碱可能是通过介导Bcl2、Bax和Caspase-3信号通路来抑制大鼠海马神经元凋亡，进而改善七氟烷诱导对新生大鼠远期认知功能损伤（图1）。

图1 各组新生SD大鼠海马Bcl2、Bax和cleaved Caspase-3表达水平比较Fig.1 Comparison of expression levels of Bcl2,Bax and cleaved Caspase-3 in the hippocampus of neonatal SD rats in each group

3 讨论

七氟烷是包括儿科在内的许多外科手术常用的吸入麻醉剂，通常会导致神经损伤和认知功能障碍[11]。动物研究[12]指出，七氟烷全麻诱导可损害幼鼠认知功能，影响海马转录水平。因此，研究有效的预防麻醉所导致的神经毒性的方法具有重要意义。远志皂苷是远志的主要活性组分，药理学研究[13]显示，远志皂苷具有抗衰老、抗氧化、抑制细胞凋亡以及改善认知功能等作用。动物实验[14]表明，远志皂苷可以通过抑制小胶质细胞内NLRP3炎症小体的激活，保护帕金森病小鼠多巴胺神经元免受炎症反应的影响。已知中药莲子心在清热、镇痛、止血方面具有显著功效，莲心碱作为莲子心的重要活性成分，可发挥抗纤维化、抗血栓形成、抗氧化以及抗凋亡等作用[15]。羊小华等[16]报道表明，莲心碱可显著抑制七氟烷诱导的新生大鼠皮质癫痫样脑电波图，且呈剂量依赖效应，可能是通过调控mTOR信号通路来发挥脑保护作用。本研究通过采用七氟烷诱导新生SD大鼠神经元损伤模型发现，各干预组新生SD大鼠血气指标无显著性差异，均在正常范围内，提示可排除缺氧以及二氧化碳潴留对大鼠脑神经元发育的影响。七氟烷诱导后新生SD大鼠皮质脑电图各项参数指标的变化表明，远志皂苷与莲心碱干预对七氟烷诱导的新生SD大鼠具有一定的脑保护作用，对新生SD大鼠急性认知功能具有积极影响。同时本研究结果还显示，七氟烷诱导后新生大鼠获取空间信息的能力和记忆储存能力明显降低，但予以远志皂苷与莲心碱干预后得到明显恢复。此外，予以远志皂苷与莲心碱干预后大鼠血清皮质酮含量显著降低，可能与远志皂苷与莲心碱共同保护神经结构和功能有关，进而无法激活下丘脑−垂体−肾上腺皮质轴，导致皮质酮水平降低。

神经元凋亡在中枢神经系统发育和许多神经退行性疾病中起着至关重要的作用。Caspase是神经细胞凋亡的有效标志物之一，其介导的信号途径与细胞凋亡进展密切相关，一旦Caspase信号途径被激活，将触发一系列程序介导细胞凋亡[17]。此外，Bcl2家族也在细胞凋亡中发挥重要作用，Bcl2、Bax是细胞凋亡过程中的两种主要调节因子，Bcl2抑制凋亡，Bax促进凋亡[18]。本研究结果显示，七氟烷诱导的大鼠海马中Bcl2/Bax显著下调，cleaved Caspase-3显著上调，而远志皂苷与莲心碱干预后，Bcl2/Bax表达显著上调，cleaved Caspase-3表达显著下调，表明远志皂苷与莲心碱可能是通过介导Bcl2、Bax和Caspase-3信号通路来抑制大鼠海马神经元凋亡，进而改善七氟烷诱导对新生大鼠远期认知功能损伤。廖丹琼等[19]报道也表明，远志皂苷可改善氧糖剥夺/再复氧诱导的大鼠海马NSCs损伤。分析原因为，远志皂苷与莲心碱均具有一定的抗炎和抗氧化作用，其机理可能是通过调节凋亡相关蛋白酶，进而抑制七氟烷诱导的海马神经元细胞凋亡；另外，还有可能是通过提高海马神经元内抗氧化酶的活性，进而减少氧化应激损伤，提示远志皂苷与莲心碱具有防治神经系统疾病的应用前景。但本研究氧化还原相关酶、蛋白等指标未纳入分析，后续有待进一步SD深入探讨远志皂苷与莲心碱对七氟烷诱发新生大鼠急性和远期认知功能损伤的详细作用机制。

综上所述，远志皂苷与莲心碱可改善七氟烷诱发新生大鼠急性和远期认知功能损伤，其机制可能与调控凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase-3表达有关，可为临床神经系统疾病防治提供科学根据。