宏基因组学技术在痤疮研究中的应用进展

李伟，王冲，刘嗣嘉，杨敏一，张云平

1.聊城大学东昌学院化学与生物系，山东 聊城252000；

2.聊城市人民医院皮肤科，山东 聊城252000；

3.香港浸会大学理学院，香港999077

皮肤覆盖于人体的表面，是人体最大的器官，皮肤微生物组是一个多样化的生态系统，通过调节皮肤的微生物组成和免疫系统功能影响皮肤的健康状况。皮肤微生物组因身体部位、年龄、地域和疾病等因素而存在差异，且还会受到环境、护肤品和药物等因素的影响。研究表明，皮肤微生物组是健康皮肤环境必不可少的组成部分，微生物群落组成的改变可能导致皮肤失去平衡，进而引起皮肤疾病[1−2]。痤疮作为最常见的皮肤病之一，影响全球约85%的青少年。痤疮是免疫介导的慢性炎症性毛囊皮脂腺单位的疾病，与多种因素有关，虽然尚不清楚其病因，但研究表明皮肤微生物及其变化在痤疮的发病机理中具有重要作用[3]。

早期人们研究微生物物种及其相互作用主要通过体外培养的方法，这种基于菌株水平的传统分离培养技术可以帮助人们认识微生物的多样性。然而许多微生物是无法经体外培养的，不同微生物的生长速度及其对培养条件的要求也存在差异，使得培养分离耗时较长且不能全面挖掘微生物的多样性[4−5]。高通量测序技术（high-throughput sequencing）的出现和发展有效地解决了这一问题，尤其是近年来发展迅速的宏基因组学技术，利用现代基因技术对样品中的大量基因进行测序，无需分离单个物种，这使得人们能够对微生物组的多样性进行深入探索，并对微生物暗物质进行表征[4]，该方法不仅可以更全面地鉴定皮肤上的微生物种类，还可以揭示微生物在转录组水平上对特定刺激的反应。该技术在人体肠道微生物组的研究中发挥重要的作用，阐明了许多疾病与肠道微生物组之间的关系[6]。由于菌群数量、样本DNA含量以及样本采集、分析技术等原因，该技术在皮肤微生物的研究中并未得到广泛和深入的应用[7]。

本文通过介绍宏基因组学技术的发展背景、概述及其应用研究进展，探讨皮肤微生物与痤疮的关系，综述宏基因组学技术在痤疮研究中的应用现状，并总结目前宏基因组学技术在皮肤疾病研究中存在的问题，以期为痤疮的宏基因组研究提供参考。

1 宏基因组学技术及其应用研究进展

1.1 发展背景

宏基因组学技术是基于基因层面的一种高通量测序技术。高通量测序技术又称下一代/第二代测序技术（next-generation sequencing technology），可一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。相比传统分离培养技术，高通量基因测序技术的出现使得人们能快速准确地得到大量微生物基因数据，从而更加全面地认识微生物的分布特征和功能特点。

扩增子和宏基因组学技术是微生物组研究中使用最广泛的高通量测序技术，不仅促进了微生物组研究的快速发展，且相应的分析方法和标准也随之发展[8−10]。扩增子测序技术通常以16S、18S或ITS等标志物基因作为研究对象，采用PCR的方法扩增出菌群的群落结构，成本低廉，适合开展大规模的研究，但由于PCR的局限性及偏好性，扩增子测序技术只能达到属水平的分辨率，虽然可以研究物种分类，但无法研究其功能。宏基因组学技术则可以弥补以上不足，其可以获取样本中所有生物的基因组信息，不仅能达到物种或菌株水平的分辨率，而且能提供微生物组的潜在功能信息，甚至可以挖掘出不可培养的微生物的基因组草图，但同时存在价格较昂贵、易出现宿主的污染等缺点[8]。

1.2 宏基因组学技术概述

宏基因组学技术通过对样本中细菌、古菌、真菌、原生动物、病毒等微生物的总DNA进行高通量测序分析，获得微生物的群落结构、功能特点和遗传特征[11−12]。

宏基因组学技术的分析流程主要包括：①样本采集；②DNA的提取；③DNA的打断测序；④宏基因组分析，包括质控定量、组装注释、物种组成和功能分析等（图1）。目前人类微生物组数据库质量较高，因此基于读长（read-based）的分析方法比较适合于人类的研究；而对于其他环境微生物，适合采用基于组装/拼接的分析方法，将原始序列组装成重叠群，进一步挖掘基因，甚至挖掘潜在的未培养微生物的基因组[8]。

图1 宏基因组测序分析流程Fig.1 Metagenomic sequencing analysis process

1.3 宏基因组学技术的应用现状

目前，利用宏基因组学技术进行的研究明显增加，这可以为微生物组的结构和功能提供全面、多维度的研究，实验权重也从培养方法的选择转移到样品的收集、DNA的提取、测序方法的选择、数据的处理和结果的可视化[8,13−15]。

宏基因组学技术已被应用于各种环境中微生物组的研究，如人体、其他动物、土壤、水体、空气等。在临床上，通过分析疾病和健康状态下的微生物组可以诊断多种类型的综合征和样本类型的传染病[16]。宏基因组学技术在识别微生物未知基因及确定功能失调的病因方面发挥重要的作用。结合转录组学、代谢组学和蛋白质组学等技术，可促进对人体微生物组的了解，为疾病诊断和治疗提供新思路和策略[17]。

但该技术的应用也存在以下问题和限制：①采样、样本处理、DNA提取和测序方法等尚缺乏统一的标准，这会导致分析结果存在较大的差异；②宏基因组测序对数据量有较高的要求，当样本中微生物细胞浓度低于105个·g−1时，无法测得其组成[18]；③对科研人员的计算机和生信数据分析能力有较高的要求，对于广大微生物和医学领域的研究者挑战较大，通常需要跨学科合作。

2 宏基因组学技术与痤疮

2.1 皮肤微生物

人体所有的皮肤表面均存在共生微生物，人类在出生后便开始了微生物的定殖，并在生命的最初几年形成稳定的共生微生物群落[19]。目前，人类皮肤上已经鉴定出40多个细菌属，常驻微生物优势菌系为放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，微生物组的分布存在个体特异性和部位特异性[20−24]。皮肤屏障与微生物群落之间的作用是相互的，皮肤给微生物提供生存环境，当皮肤微生物与皮肤防御机制处于平衡时，微生物可以抑制细菌的过度增殖和各种致病菌的攻击，促进皮肤健康；当皮肤环境发生变化时，微生物与宿主之间的平衡被打破，可能会引起皮肤疾病[25]。

2.2 痤疮与微生物

痤疮是一种慢性炎症皮肤疾病，常发生于皮脂腺丰富的皮肤区域，在青少年群体中发病率高。痤疮在不同种族青少年中的发病率高达44%～95%，但同时约50%患者可自行恢复[26]。痤疮是免疫介导的慢性炎症性疾病，大量的研究者认为，痤疮是青少年期面部皮肤微生物发生变化，取代了以前的儿童皮肤稳态，皮肤菌群与免疫系统相互作用而自然发生的短暂性炎症[27−29]。

痤疮丙酸杆菌长期以来被认为是痤疮的致病因素，但同时其通过皮脂中甘油三酸酯的水解和释放微生物脂肪酸以防止病原体的定殖和入侵，并促进酸性物质的产生，维持皮肤表面的pH平衡[28]，因此探究痤疮丙酸杆菌对皮肤的影响具有重要意义。痤疮丙酸杆菌与其他皮肤分枝杆菌属（如颗粒丙酸杆菌、贪婪丙酸杆菌）以及葡萄球菌、单甲胞菌、棒状杆菌和共生真菌马拉色菌共存于皮肤表面和皮脂腺毛囊中。与健康对照毛囊相比，痤疮病灶部位更易形成痤疮丙酸杆菌生物膜，这些生物膜以微生物结构存在，包含金黄色葡萄球菌、角质层细菌和马拉色氏菌等种群[30−31]。在皮脂腺中，生物膜基质可充当生物胶，形成物理屏障限制皮脂排出，促进内腔中角质细胞的堆积，从而导致角质堵塞和粉刺形成[32]。

2.3 痤疮的宏基因组学研究进展

一项对各种人类皮肤部位的宏基因组学分析研究发现，个性和皮肤形貌决定了微生物组的组成[33]。比较痤疮皮肤和健康皮肤的微生物组可以提高对痤疮病理生理机制的理解。

目前对于痤疮丙酸杆菌定殖引起痤疮的认知是早期基于培养的方法得出的偏见性结论[34]。营养丰富的人工培养条件，不同于皮肤干燥以及营养贫乏的条件，并且低估了微生物群落的多样性。为了获得皮肤微生物组的多样性，研究人员开始应用先进的测序方法以寻找保守分类标记之外的可变序列，如16S扩增子分析或Shotgun分析收集全部基因以获得所有常驻细菌的宏基因组[35]。宏基因组学可以获得单核苷酸多态性以及微生物群落的代谢谱，在菌株水平上具有更高的分辨率，近年来，已成为微生物组研究的热门技术。但由于其价格昂贵和对样品基因负荷量的要求较高，在痤疮微生物组的研究中，更多地采用16S扩增子技术，仅有少量研究采用宏基因组学技术。

Hall等[36]用16S扩增子和宏基因组学技术分析了不同采样方法在痤疮研究中的差异。采用3种采样方法分别从20名12～40岁皮肤健康人群和痤疮患者脸颊获取样品，棉拭子采集皮肤表面的微生物，毛孔条和氰基丙烯酸酯胶采集毛囊微生物。研究结果表明，棉拭子的采样方法可获取皮肤表面的微生物，毛孔条和氰基丙烯酸酯胶可进行毛囊采样，其中毛孔条可分离出部分破裂的毛囊结构及其微生物，氰基丙烯酸酯胶的采样深度最大，可获得完整的毛囊结构及附属微生物。2种毛囊采样方法获取的样品具有相似的微生物物种相对丰度水平，α和β多样性无显著差异。与毛囊样品相比，棉拭子获取的皮肤表面样品具有更高的α多样性，痤疮丙酸杆菌的相对丰度无显著差异。皮肤表面和毛囊微生物群落在最丰富的物种组成上存在重叠，但某些细菌和病毒有其各自独特的生态部位。

Fitz-Gibbon等[23]通过16S扩增子测序和shotgun宏基因组测序技术对比分析健康皮肤和痤疮皮肤的毛囊微生物差异，使用市售毛孔条从受试者的鼻子采样皮肤微粉刺样品和正常毛囊样品，结果表明，毛囊单位中常见的物种包括痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、肱骨丙酸杆菌和颗粒状丙酸杆菌等，其中痤疮丙酸杆菌占比最高。痤疮患者痤疮丙酸杆菌的相对丰度与健康人群比较无显著差异。分析痤疮丙酸杆菌16S rDNA序列10个主要核糖型的分布情况，结果表明，痤疮患者痤疮丙酸杆菌的种群结构与健康人群比较差异显著，分析原因为与痤疮相关的菌株中含有的某些独特基因座可能在痤疮的发病机理中发挥重要作用。Barnard等[35]增加了噬菌体和毒性相关因子的研究，并因此提出益生菌和噬菌体疗法调节皮肤微生物的治疗建议。从38例痤疮患者和30名年龄匹配的健康人群中采用毛孔条的方法采集皮肤毛囊部位样本，通过宏基因组学Shotgun测序，结果发现，健康人群皮肤中丙酸杆菌和痤疮丙酸杆菌噬菌体的相对丰度较高，痤疮患者中，皮肤菌群在物种水平和痤疮丙酸杆菌菌株水平的多样性更高，毒性相关因子富集且代谢合成基因丰度较低。皮肤菌群的总体毒性受宏基因组成分平衡的影响，且与毒力相关的基因编码富含与疾病相关的痤疮丙酸杆菌菌株的抗菌肽、细胞毒素和蛋白酶。Tao等[37]利用宏基因组测序技术对比痤疮治疗前后病变区域的微生物差异，对11例患有严重面部痤疮患者进行5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法（5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy，ALA-PDT）治疗，对治疗前后病变区域采样。宏基因组测序结果表明，痤疮皮肤杆菌是最主要的物种，其次是表皮葡萄球菌和荧光假单胞菌；ALA-PDT通过杀死痤疮丙酸杆菌、增加荧光假单胞菌和微生物群多样性而发挥治疗作用，同时，还具有抑制重度痤疮毛囊皮脂腺单位微生物群的功能。

尽管宏基因组学技术优势明显，但存在成本偏高、无标准方案可供参考、皮肤样品中微生物含量较低、易受到宿主污染等缺点，影响测序结果的准确性和全面性。因此，利用宏基因组学技术进行的皮肤微生物研究相对较少。痤疮病灶部位不同于特应性皮炎和银屑病，其形成部位有毛囊结构，因此，需研究皮肤表面和毛囊内部的微生态，以明确其差异。不同采样方法对基因测序分析和痤疮微生态研究的影响也有待进一步明

确[33−34,36,38−39]。皮肤样本中微生物含量较低，环境微生物会对其产生较大的影响和干扰，因此，采样过程和后续的样本处理及DNA提取过程均应严格遵循无菌操作，最大程度减少环境微生物对结果的影响。

2.4 肠-皮轴及多组学研究

近年来，人们已经对肠-脑轴的研究有了一定的认识，诸多脑部相关疾病均与肠道菌群相关。在皮肤疾病的研究中，建议进行肠-皮轴研究，同时，采集健康组和疾病组的肠道和皮肤微生物样本进行宏基因组分析。此外，在资金条件允许的情况下，进行代谢组学、病毒组学、转录组学等多组学分析，对数据整合研究，解析皮肤和肠道微生物群落的结构与功能，比较疾病组与健康组在不同水平下物种的活性丰度、基因的差异表达、代谢途径的强弱，进而解析生物学过程的内在机制，为痤疮的发病机制研究和临床治疗提供支持。

3 展望

一百多年来，人们一直在研究痤疮丙酸杆菌在痤疮发病中的作用，但目前仍存在争议。大量证据表明，痤疮丙酸杆菌的不同菌种和菌株在多种细胞类型中诱导不同的免疫反应，且痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌中宿主互作和微生物互作的相关基因，在介导和促进痤疮疾病中发挥重要作用。痤疮发病机理的进一步明确还需要大量的研究，且对其中微生物所发挥作用的研究必不可少，而采样方法和测序方法会影响研究结果和结论。宏基因组学技术可捕获更多的样品多样性，达到更精细的分辨率，有望成为今后的痤疮微生物组研究中重要的技术手段，其可打破培养组学和扩增子分析技术的局限，提高人们对微生物在痤疮发病中的认识。皮肤微生物不同于肠道微生物，其微生物含量较低，采样过程中环境微生物会对其产生较大的影响和干扰，因此，采样过程及后续的DNA提取和测序均应严格遵循无菌操作，最大程度减少环境微生物对结果的影响。未来宏基因组学的研究还需要更加统一可靠的采样、测序和数据分析方法及标准。此外还需从不同痤疮种类和严重程度的患者获取病灶毛囊微生物组，对不同方法治疗前后微生物组的表型变化进行纵向的宏基因组学评估，并增加对痤疮有关菌群之间的相互作用和与宿主间互作的研究，同时，进行代谢组学、病毒组学、转录组学等多组学综合研究，这对于更好地理解病理生理以及制定治疗策略至关重要。